[发明专利]一种检测稻瘟菌效应蛋白从水稻根部转移至叶缘的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种检测稻瘟菌效应蛋白从水稻根部转移至叶缘的方法，属于植物保护和生物技术领域。

背景技术：

病原细菌是通过Ⅲ型分泌系统转运效应子，其转运机制研究得较为清楚。但对于丝状真菌来说，尽管诸如吸器等专化的侵染结构参与了效应蛋白的转运，但其效应蛋白是如何被转运进入寄主细胞仍然未知。卵菌效应蛋白都具有一个保守的基序即RXLR（X代表任意一个氨基酸），该基序位于信号肽的下游并且参与效应蛋白在寄主细胞内的转运。许多研究表明，RXLR基序在卵菌效应蛋白转运进入寄主细胞中起作用。第一，RXLR基序在序列上和转运位置与疟原虫将效应蛋白转运进入寄主红细胞所需的（HT）/Pexel基序是一致的。疟原虫将包含致病疫霉菌效应蛋白AVR3a的RXLR基序和PH001D5在内的一段30个氨基酸并且融合了绿色荧光蛋白序列转运进入寄主红细胞中，其结果表明RXLR和HT/Pexel在功能上可交替。第二，RXLR基序并不是致病疫霉效应蛋白AVR3a直接在寄主细胞中表达所必需的，也就是说该基序是效应蛋白转运必需而不是表达所必需的[12]。第三，通过分析疟原虫效应蛋白ATR1和ATR13的C端序列，发现序列具有很高的多态性，说明这两个效应蛋白是与寄主抗性蛋白共同进化的。综上所述，可以认为卵菌RXLR效应蛋白是有两个功能域的模式蛋白。N-端功能域包含有信号肽和RXLR基序，C-端具有在寄主细胞中起作用的功能。卵菌RXLR效应蛋白与细菌Ⅲ型效应蛋白相比，它们的功能域可能是在不同选择压力下形成的。Dou等人的研究表明，RXLR介导的效应蛋白转运即使在病原菌不存在的情况下，效应蛋白也能进入寄主细胞，这一结果揭示了RXLR效应蛋白转运仅取决于RXLR蛋白和识别RXLR蛋白的寄主蛋白。那么包括稻瘟病菌在内的真菌效应蛋白的转运机制如何，是否同卵菌效应蛋白一样存在与RXLR基序相类似的共有基序？有研究表明，稻瘟病菌效应蛋白能在无病原菌存在下从水稻根部转移至地上部的叶芽部。

目前，还没有稻瘟病菌效应蛋白能在无病原菌存在下从根部转移至地上部水稻叶缘的报道。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种检测稻瘟菌效应蛋白从水稻根部转移至叶缘的方法。

本发明的一种检测稻瘟菌效应蛋白从水稻根部转移至叶缘的方法，它将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物（利用IPTG化学诱导的方法获得表达产物采用过程不再赘述）于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液（20mMTris-HCl，pH7.4；200mMNaCl；1mMEDTA；10mMβ-巯基乙醇）悬浮菌体，在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清，将该原核表达产物，利用GST纯化柱（购买自安玛西亚公司）纯化，将纯化后的表达产物按照5.0mg/ml（含25mMMES）的浓度处理感病水稻品种丽江新团黑谷的根尖0.5cm处6h，灭菌水漂洗4h，将处理后的水稻植株的叶片进行石蜡切片，用免疫细胞化学方法处理水稻叶片切片，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架。

作为优选，所述免疫细胞化学方法处理方法为：将大豆根尖放入固定液抽气10min，室温固定1hr；固定完毕后用PEMT洗三次，每次10min；37℃条件下酶解1hr；酶解后PEM冲洗三次,每次10min；用0.1MPBS（pH7.2）溶液配制NaBH4，使其浓度为1mg/ml处理大豆根尖20min；室温用50mMGly封闭30min；加一抗，4℃过夜，冲洗一抗：PBS冲洗三次,每次10min；加二抗（1:600）,37℃、闭光条件下,3hr；冲洗二抗：PBS冲洗三次,每次10min；加上抗荧光淬灭剂后，封片。

本发明的有益效果为：它通过一系列方法鉴定到了一种从水稻根部转移至地上部叶缘的稻瘟病菌效应蛋白，可为今后进一步研究稻瘟病菌与水稻互作时的水稻系统获得抗性提供重要的实验依据。

具体实施方式：

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过示出的具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。