[发明专利]消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用

权利要求书

1.一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系，其特征在于，

该体系包括：2.5μL的10×退火缓冲液II，1μL的100mM MgSO₄、2μL的500mM NaCl、1μL的5μM反向引物、1μL的5μM正向引物、1μL的52.5mM ATP溶液、1μL的3.5mM dNTPs、0.75μL的酶混合物及1μL的5×SYBR Green I。

2.根据权利要求1所述的消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系，其特征在于，选取40bp的链作为模板链，则以模板链5’端的18个碱基相同的18bp的链作为正向引物，以与模板链3’端24个碱基互补的24bp的链作为反相引物。

3.一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据待扩增的目的片段模板设计引物，包括正向引物和反向引物：

模板序列为：5'-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3'；

设计正向引物为：5'-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3'；

设计反向引物为：5'-CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA-3'；

2)构建HDA反应体系，包括：

2.5μL的10×退火缓冲液II，1μL的100mM MgSO₄、2μL的500mM NaCl、1μL的5μM反向引物、1μL的5μM正向引物、1μL的52.5mM ATP溶液、1μL的3.5mM dNTPs、0.75μL的酶混合物及1μL的5×SYBR Green I；

3)将体系中各个反应物混合均匀，进行HDA等温扩增，根据荧光信号检测扩增结果，判断实现零背景旋酶依赖扩增反应。

4.根据权利要求3所述的消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，其特征在于，步骤2)所述的HDA反应体系参照标准的HDA反应体系，对ATP和dNTPs浓度做调低处理。

5.根据权利要求3所述的消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，其特征在于，步骤3)所述的荧光信号检测扩增是采用96 System进行实时荧光检测，每60s测定一次，设定温度为60℃。

6.根据权利要求3所述的消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，其特征在于，所述的模板为合成的单链或经过细胞端粒酶扩增之后的单链。

7.权利要求1所述的消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系在检测细胞端粒酶活性中的应用。