[发明专利]一种原代肝细胞体外复极性的培养方法

说明书

本发明涉及一种原代肝细胞体外复极性的培养方法，将肝细胞上样于微孔培养板，50g‑250g离心1‑10min，去除微孔培养板表面多余细胞悬液，加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。本发明以力学紧凑种植方式种植原代成熟肝细胞群，肝细胞在结构和功能学上的复极性均提前至种植后第12h形成，加快了体外肝细胞群在三维环境下的复极性速度，可为肝组织工程提供具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞。

技术领域

本发明涉及肝脏组织工程学技术领域，尤其涉及一种原代肝细胞体外复极性的培养方法。

背景技术

肝组织工程学在药物筛选、体外支持治疗、以及肝组织生理与疾病模拟模型等领域中具有重要的基础研究和临床应用价值。具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞是肝组织工程的重要细胞成分。如何获得具有最近似体内功能的工程化肝组织是该领域研究的核心目标和成功的关键技术之一。

成熟肝细胞在功能和结构上具有与其他上皮细胞不同的复杂极性特征，该极性是肝细胞发挥生理功能的基础。经酶解离开体内组织内环境后，成熟肝细胞失去极性，原有功能表型发生迅速减退。在一定的体外条件下，肝细胞恢复并维持其极性，保持较高的功能水平，并维持较长时间，此现象称为肝细胞复极性。肝细胞复极性包括以下特征：重新出现典型肝细胞间极性超微结构和功能性胆小管排泌。一般认为，新分离的肝细胞只有恢复细胞极性后方具备正常的细胞功能。因此，通过各种技术和方法处理以恢复细胞极性，是肝脏组织工程学的重要观察指标和目标。

二维和三维培养的原代成熟肝细胞，在适合的技术细节条件下，都有可能发生复极性现象。由于更接近生理特征，促进三维肝细胞复极性是目前肝组织工程技术研究的着力点。如肝细胞微球体，作为一种获得较多研究的三维肝组织体，其形成体现了典型的体外肝细胞自组织过程：新鲜分离的原代肝细胞有自发聚集的趋势，它们会在聚集体的基础上，逐渐紧凑并重新建立极性结构。目前大多研究通过优化培养基成分，提高氧气供应，改良培养基质的化学或物理结构以及改进种植方式等手段，使体外肝细胞复极性。

Ryo Sudo等应用鼠尾胶原三明治构型培养大鼠原代肝细胞，细胞培养液由基本培养基(DMEM)，20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，25mM碳酸氢钠，30mg/L L-脯氨酸，10^-7M地塞米松，10mM烟酰胺，1mM的抗坏血酸-2-磷酸，10ng/mL表皮细胞生长因子和青霉素链霉素双抗组成，在肝细胞种植后第72h第一次检测到功能性胆小管对荧光素二乙酸(FDA)的排泌功能(Sudo R.,Mitaka T.,Ikeda M.,and Tanishita K.(2005)Reconstruction of 3Dstacked-up structures by rat small hepatocytes on microporous membranes.TheFASEB Journal19(12):1695-7.)。Mark A.Talamini等用同法培养大鼠原代肝细胞，在肝细胞种植后48h检测到膜抗原蛋白的非对称性极性分布(Talamini,M.A.,Kappus B.,andHubbard A.(1997)Repolarization of hepatocytes in culture.Hepatology25(1):167-72.)。这是已有研究报道中肝细胞(结构和功能学)复极性的形成出现最早的时间(48h-72h)。

上述现有技术存在以下主要缺点：

1.虽然使原代肝细胞在体外条件下发生了复极性的行为，但不是生理性恢复。例如，二维单层培养原代肝细胞基本没有形成肝板样结构，形成的囊泡样胆小管片段接种48h后消失，肝细胞膜区域蛋白特异性分布在培养后1周后基本消失。

2.三明治构型培养的原代肝细胞提高了生理性原代肝细胞复极性的能力，肝细胞形成肝板样结构，伴胆小管网络形成，肝细胞膜区域蛋白呈特异性分布，但提高程度不显著。例如，三明治培养原代肝细胞在72h时白蛋白合成量为30μg/10⁶细胞/天，尿素合成量为120μg/10⁶细胞/天。