[发明专利]含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用

说明书

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，涉及一种含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,PCV2)呈世界性分布，在家猪和野猪体内均有发现。目前认为PCV2是全球范围内危害养猪业的一种重要病原，可引起猪的多种疾病，称为PCV2相关性疾病(PCV2-associateddiseases,PCVAD)。PCVAD包括断奶仔猪多系统消耗综合症(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)，猪皮炎和肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)和繁殖障碍等疾病。PCV2感染可造成猪群免疫力下降，可导致多种疫苗免疫失败，并导致猪只死亡率增加，据报道PCV2感染可导致猪场猪只死亡率的增加从2-3％到14-30％不等，对养猪业影响巨大。使用快速、灵敏的PCV2病毒检测方法用于养猪场疫情监测非常重要。

PCV2属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是一种小而无囊膜、二十面体、共价闭合、环状的为单股DNA病毒，基因组大小1.7kb。PCV2主要的保守序列位于ORF2基因，而且PCV1和PCV2基因序列最大的差异也位于ORF2基因内，故目前检测PCV2的NAT方法均以ORF2作为靶标进行设计。目前，基于核酸扩增检测方法(NAT)的特异和高效，国内外报道了很多NAT方法和试剂用于猪场PCV2快速检测。但由于NAT检测方法属于相对复杂的生物测定方法，对于同样的样品，因DNA提取方法效率的不同，寡核苷酸引物、探针的效率不同，不同品牌TaqDNA聚合酶扩增效率的不同都会给检测结果带来差异，甚至出现不同的结果，进而影响结果的判定。

为保证检测质量，评估不同NAT检测方法效力和实验室检测能力，研制均匀、稳定，可进行量值传递的标准样品用于PCV2的检测质控非常必要。但有关PCV2NAT检测的标准样品的研究鲜有报道。目前用于PCV2NAT检测的质控品为灭活病毒和质粒DNA制备，或制备复杂且需要生物安全设施，或虽制备简单，但不能质控DNA提取过程，而且易造成气溶胶污染。因此均存在明显不足之处，不能满足实际需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用腺病毒重组技术，制备了一种内含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒，将该重组腺病毒用做核酸扩增检测方法(NAT)的标准样品，该标准样品具有稳定、制备简单、无生物安全风险的特性，病毒粒子结构与猪原核病毒大体类似、可用于针对猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒的质量控制和评价。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在猪圆环病毒核酸扩增检测中作为标准样品的应用。

本发明所述的含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒为二十面体病毒粒子结构，与猪圆环病毒2型结构基本一致，而且腺病毒背景清楚，使用安全方便，在猪圆环病毒核酸扩增检测中作为标准样品使用可全程质控病毒DNA提取和扩增检测。

本发明提供的含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒是通过如下方法制备：

1)获得用于猪圆环病毒2型检测的ORF2基因序列，如序列表中SEQIDNO：1所示；

所述ORF2基因可以通过合成或者RT-PCR扩增获得，克隆于质粒载体上，例如pMD19-T，该片段是猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒检测的区域。

2)将通过步骤1)获得的PCV2ORF2基因的序列克隆于腺病毒穿梭载体上，例如pacAd5CMVK-NpA，获得重组穿梭质粒，例如CMV-PCV2-ORF2；

在本发明的一个实施方案中：使用KpnI和HindIII对重组质粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭载体pacAd5CMVK-NpA双酶切后，经连接转化构建CMV-PCV2-ORF2重组穿梭质粒，将构建好的质粒经PCR与酶切鉴定，由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。

3)将步骤2)获得的重组穿梭质粒与骨架质粒使用限制性内切酶线性化，纯化后共转染HEK293T细胞，经连续传代获得稳定增殖的重组腺病毒；