[发明专利]A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺

权利要求书

1.A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，包括以下步骤：

（1）培养脑膜炎球菌；

（2）利用培养的脑膜炎球菌提取粗制多糖；

（3）将粗制多糖提纯后制成脑膜炎球菌精糖；

（4）对精糖进行活化和衍生，该精糖的活化和衍生过程如下：

（41）称取脑膜炎球菌精糖并将其溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的多糖溶液，并调节pH至9.0；

（42）将CDAP用乙腈溶解成浓度为100mg/ml的CDAP溶液；然后按多糖：CDAP=1：0.4～0.6的重量比例，往多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟制成CDAP混合液；

（43）将ADH用0.2mol/L的NaHCO₃溶解成浓度为100mg/ml的ADH溶液，按多糖：ADH=1：3～5的重量比例，往CDAP混合液中加入ADH溶液，室温搅拌1小时；

（44）再采用0.05mol/L的氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包进行过滤，最后冷冻干燥后即为多糖-ADH衍生物。

2.根据权利要求1所述的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，所述步骤（1）的具体过程如下：

（11）制备纯化的工作种子批菌种：将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基上，在38℃条件下培育20h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养基上进行二次培养，再在38℃条件下培育12h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种；

（12）将工作种子批菌种溶解到无菌水中，将其接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35～37℃的环境下培养16～20小时后，挑选出健壮且无杂菌污染的菌种；将开启后的纯化种子接种到半综合液体培养基中进行活化培养；活化培养的条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min，培养时间为6～8h；最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养，即可制备数量适宜的生产用种子；其中扩增培养用培养基为半综合液体培养基中；培育条件为温度35～37℃、pH7.0～7.2、搅拌速度140～150r/min；

（13）将生产用种子接种至发酵罐培养6～12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35～37℃，培养基pH为7.0～7.2，发酵罐中搅拌速度为140～150r/min，接种量为10～15万/ml。

3.根据权利要求1所述的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，所述步骤（2）的具体过程如下：

（21）将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；

（22）在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；

（23）将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h使多糖和CTAB解离，离心收集上清液；

（24）在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到25%，在2～8℃静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75～80%，充分振摇使多糖沉淀，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；

（25）用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。

4.根据权利要求1所述的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于，所述步骤（3）的具体过程如下：

（31）将粗制多糖溶解于8%～12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0.8～1.2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；

（32）收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；

（33）在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0.2～0.4mol/L，然后加入乙醇至乙醇体积终浓度为70～78%，充分混匀后2～8℃静置过夜；

（34）离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。