[发明专利]一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法及应用，其解决了现有DNA双链断裂碎片数目检测中不能定量的问题。主要是采用限制性内切酶完全酶切待分析的完整目标基因(组)获得标准品，再利用标准曲线法对任何已知DNA序列的基因(组)双链断裂碎片数目进行定量分析。本标准品制备方法简便、成本低廉、定量结果可靠，可广泛应用于已知DNA序列的各种生物的基因(组)双链断裂碎片数目的定量分析。

技术领域

本发明涉及DNA双链断裂碎片数目的定量分析技术领域，具体涉及一种检测DNA双链断裂碎片数目的标准品的制备方法以及标准品的应用。

背景技术

生物体内部或外界的多种不利因素如细胞内代谢产物、电离辐射、亚硝铵类致癌物等均可导致DNA分子断裂。若DNA发生双链断裂，则机体会启动同源重组修复通路或(和)非同源末端连接修复通路对其进行修复，若不能被有效修复则会产生DNA双链断裂，累积起来，可能会对细胞的正常生理功能造成影响，甚至导致病变的发生。因此，定量分析DNA双链断裂数目的多少对评估生物遗传的稳定性非常重要。

虽然检测DNA双链断裂的方法很多，但大部分方法如流式细胞术、TUNEL法等检测的是DNA单链断裂和DNA双链断裂的总和，仅有小部分方法检测的是DNA双链断裂。目前检测DNA双链断裂的方法主要有γH2AX法、单细胞凝胶电泳法及脉冲电场凝胶电泳法等。γH2AX法是利用DNA双链断裂后，会形成磷酸化的γH2AX，即γH2AX焦点。焦点数与DNA双链断裂点数间存在一一对应关系，通过计数γH2AX焦点数可实现DNA双链断裂点的定量分析。但在实际工作中，计数γH2AX焦点数需在荧光显微镜下采用手工方法或借助特定软件进行，当γH2AX焦点数过多、γH2AX焦点过于密集甚至发生重叠时，手工计数或软件分析均会出现较大偏差，因此，一般分析中γH2AX法的结果常以含γH2AX焦点细胞在总细胞中所占百分比或γH2AX焦点的平均几何荧光强度表示，而非以DNA双链断裂点数目表示。单细胞凝胶电泳法及脉冲电场凝胶电泳法检测的是DNA双链断裂在总DNA中所占的比例，无法对DNA双链断裂数进行定量分析。综上所述，目前的主要检测方法均难以对DNA双链断裂数目进行定量分析。难以定量DNA双链断裂数的主要原因是缺乏合适的已知量的标准品用以推测未知样本中DNA双链断裂数，因此，我们试图提供一种应用于定量分析DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法及其应用。

限制性内切酶可以特异识别特定核苷酸序列并将其切割，使完整的DNA产生特定断裂碎片数目。限制性内切酶切割完整的DNA分子后产生的DNA双链断裂的数目与该酶特异识别的核苷酸序列在DNA分子中出现的频率成正比。不同限制性内切酶特异识别的核苷酸序列不同，该核苷酸序列在DNA分子中出现的频率也不同，因而用不同的限制性内切酶切割DNA分子可获得不同数量的DNA双链断裂片段。本法借助限制性内切酶完全酶切DNA双链断裂阴性标本制备定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品，并通过识别特定序列的软件扫描，计算出已知序列的基因(组)DNA标准品中限制性内切酶特异识别序列在基因(组)中出现的次数，得到标准品中DNA双链断裂碎片的数目。制备方法简便，成本低廉，结果可靠，并可广泛应用于各种生物已知基因(组)序列的DNA双链断裂碎片数的定量检测，解决了目前暂无定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品这一难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法以及该标准品的应用，以克服由于暂无DNA双链断裂标准品而导致现有检测技术难以对DNA双链断裂碎片数进行定量分析的不足。

一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法，用不同的限制性内切酶分别完全酶切已知序列的基因或基因组DNA所得碎片即为标准品。

上述用于制备标准品的对象为完整基因或基因组，即DNA双链断裂阴性标本，要求出现DNA双链断裂的比例＜5％。

能够利用上述方法制备的标准品采用标准曲线法对待测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析，所述的标准品与待测样品的DNA类型相同。