[发明专利]一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法

权利要求书

1.一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述方法采用的是除菌培养，过渡培养和传代培养；培养过程中使用三种培养基：除菌培养基、过渡培养基和传代培养基，除菌培养使用的培养基为贫养份培养基；过渡培养使用的培养基为富养份培养基；传代培养使用的培养基为富养份培养基。

2.根据权利要求1所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述的除菌培养基成份：琼脂或琼脂替代品，其重量百分比为0.25％-0.3％；营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，其重量百分比为0.05％-0.1％；其余为原生境过滤消毒海水。

3.根据权利要求2所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述的除菌培养基的制作方法为称取0.25-0.3g琼脂或琼脂替代品，0.05-0.1g营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，加过滤消毒海水至100g，放入锥形瓶中加热使琼脂全部融化，倒入灭菌后的培养皿中自然冷却至室温，得到除菌培养基。

4.根据权利要求1所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述的过渡培养基成份：琼脂或琼脂替代品，其重量百分比为0.3％-0.45％；营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，其重量百分比为0.25％-0.35％；其余为原生境过滤消毒海水。

5.根据权利要求4所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述的过渡培养基的制作方法为称取0.25-0.45g琼脂或琼脂替代品，0.25-0.35g营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，加过滤消毒海水至100g，放入锥形瓶中加热使琼脂全部融化，倒入灭菌后的培养皿中自然冷却至室温，得到过渡培养基。

6.根据权利要求1所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述的传代培养基成份：琼脂或琼脂替代品，其重量百分比为0.25％-0.4％；营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，其重量百分比为0.25％-0.45％；其余为原生境过滤消毒海水。

7.根据权利要求6所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于所述的传代培养基制作方法：称取0.25-0.4g琼脂或琼脂替代品，0.25-0.45g营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，加过滤消毒海水至100g，放入锥形瓶中加热使琼脂全部融化，倒入灭菌后的培养皿中自然冷却至室温，得到除菌培养基。

8.根据权利要求1所述的一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法，其特征在于它的具体步骤如下：

1)消毒：所有使用仪器器皿严格消毒；

2)活体筛选：从取回的样品中，选取一小块加入海水搅拌均匀，过0.5mm和0.05mm的分样筛，0.5mm分样筛在上0.05mm分样筛在下，反复清洗分样筛，将清洗液按规格倒入不同已标记好的器皿中，在体显镜下观察，用吸管吸取自由生活海洋线虫；

3)活体清洗：将步骤2)吸取的自由生活海洋线虫样品滴入清洗皿，清洗皿盛有消毒的过滤海水，进行清洗，清洗后再将活体移入盛有消毒的过滤海水容器中；

4)除菌培养：吸取步骤3)处理后的自由生活海洋线虫10-20条滴入除菌培养基，进行除菌培养，恒温培养，温度保持20-25℃，时间3-5天；

5)过渡培养：从除菌培养基转移自由生活海洋线虫，清洗后，植入过渡培养基，恒温培养，温度保持20-25℃，时间14-20天；

6)传代培养：从过渡培养基转移自由生活海洋线虫，清洗后植入传代培养基中，恒温培养，温度保持20-25℃，时间25天以上。

9.根据权利要求1所述方法获得的自由生活海洋线虫在自由生活海洋线虫的分离与培养中的应用。