[发明专利]一种猪瘟重组疫苗

说明书

本发明公开了一种猪瘟重组疫苗，通过构建猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联的真菌特异性双T‑DNA安全表达载体；利用PEG法、农杆菌介导法或电击法转化食药用真菌原生质体，所述的食药用真菌为金针菇、平菇和蛹虫草、灵芝；经鉴定为阳性的菌丝体，培养获得T1代子实体，利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达猪瘟病毒基因的转基因食药用真菌。通过转基因真菌菌丝的发酵培养，制备猪瘟重组疫苗。利用本发明生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低，具有广泛的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明属于基因工程和生物医药技术领域，具体涉及一种猪瘟重组疫苗。

背景技术

猪瘟又称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒（Classical Swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，因其给人类造成巨大的经济损失和严重公共卫生问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。猪瘟属于我国规定的一类烈性动物传染病，据不完全统计，猪瘟每年给我国造成的经济损失近100亿，对我国养猪业的危害极其严重。国家畜禽重大疫病攻关课题组首席科学家谢庆阁也认为，在生产实践中，有很多猪病的发生与猪瘟病毒感染有关。

传统疫苗的应用为我国动物疫病的防控做出了巨大贡献，目前依然是我国控制动物传染病的主要手段。传统疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗，使用兔化弱毒疫苗株进行强制免疫控制猪瘟，仍然是我国目前最为流行和有效的防治手段。但是，常规弱毒疫苗免疫的最大缺点是难以用血清学方法与自然感染区分开，使得出口受到限制而蒙受损失。因此，开发能用血清学方法区分免疫猪与感染猪的新型疫苗（DIVA疫苗）成为当务之急。

在过去的十几年中,曾经应用各种新技术针对猪瘟开发新型DIVA疫苗,但是投入了市场的只有E2亚单位疫苗。还有人尝试将E2蛋白抗原域A或者B/C缺失,制成亚单位疫苗。另外，仅含有E2部分肽段的亚单位疫苗也已有报道。目前比较成功的是杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。因为去掉了跨膜区，表达的重组蛋白高水平地分泌到昆虫细胞培养液中。另外，有研究人员采用同样技术路线，研制出E2亚单位疫苗，这两种亚单位疫苗均已商品化。

基因工程疫苗以其安全性好、质量均一、生产成本低、适合开发多价苗和联苗等诸多优点，成为新型疫苗的研究焦点和开发方向。近年来我国在兽用生物制品研发领域发展迅速，一些兽用基因工程疫苗通过注册，这为我国动物疫苗产业注入了新的生机和活力。目前已上市的兽药基因工程疫苗已经在禽流感、口蹄疫、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、禽法氏囊病等对畜禽养殖业危害大的疫病防控中广泛使用，并发挥了重要作用，成为传统疫苗的有效补充甚至替代品。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用食药用真菌菌丝体生物反应器生产的可饲猪瘟重组疫苗。

一种融合蛋白基因E2-Erns，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

一种融合蛋白E2-Erns，其氨基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

一种表达载体pCB130NG-E2-Erns，它是：

1）用HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1；

2）在pCB130-1的SphI位点处引入SEQ ID NO.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2；

3）pCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG；

4）经SalI和 KpnI，在pCB130NG中插入SEQ ID NO.4所示的基因。