[发明专利]亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药试剂领域，尤其涉及基因诊断试剂盒，具体是指一种亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)是一碳单位代谢酶，存在于动物肝脏。是叶酸甲基化过程中的关键酶，其主要作用是可将5,10-四氢甲基叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，为同型半胱氨酸转化为蛋氨酸提供甲基，并且是DNA、以一碳单位的形式参与嘌呤和嘧啶的合成，并为DNA、RNA和蛋白质甲基化提供甲基，影响DNA代谢。

蛋白质和神经传递因子等多种生物基质的甲基供体。甲硫氨酸为人体内的必需氨基酸，甲硫氨酸合成受阻使蛋白质合成异常。作为甲基供体参与甲硫氨酸代谢，从而维持血浆同型半胱氨酸(Hcy)正常水平，Hcy代谢途径如图1。MTHFR 677C-T突变突变后，其生物活性仅有正常酶活性的50％，并且其与血浆同型半胱氨酸升高有关。MTHFR C677T突变位点是目前发现的MTHFR基因最常见的不耐热错义突变，研究表明该突变导致MTHFR酶活性下降使Hcy甲基化障碍，导致Hcy水平升高。

1、MTHFR与相关疾病

1.1 MTHFR与心血管疾病

高同型半胱氨酸血症是心血管疾病危险因子。MTHFR是Hcy代谢的关键酶，该基因C677T在Hcy代谢途径是最为常见的突变类型。C→T的突变使其活性和耐热性降低而引起Hcy血中水平升高，血浆Hcy水平升高可直接或间接的损伤血管内皮细胞，使得ET-1合成增加，NO及PGI2分泌减少，破坏血管舒、缩因子的平衡。搞Hcy还可刺激血管平滑肌细胞增殖，降低血管壁的顺应性，致血管壁弹性降低。因此Hcy水平的升高参与了心血管的病理生理过程。

MTHFR 677C→T突变致心血管病的机理如下：1.内皮毒性的作用：MTHFR 677C→T突变导致Hcy在体内水平升到，可引起内皮细胞损伤，破坏血管壁弹力层和胶原纤维致血管弹性下降。机理可能是：a.Hcy在细胞内发生自氧化，产生氧自由基，导致细胞结构破坏和功能的改变；b.Hcy降低细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的水平，消弱了其阻止NO氧化失活的作用，增强了脂质过氧化物与过氧化氢对细胞损伤效应；c.改变内皮细胞基因表达，诱导细胞凋亡。2.刺激血管平滑肌细胞增生：Hcy促进血管平滑肌细胞增殖，血管顺应性下降，促进动脉硬化的形成。3.对凝血功能的影响：Hcy改变凝血因子含量和活性促进血栓形成。Hcy促进apoB自由胺基和LDL巯基化使LDL密度增加，Hcy还参与炎症反应与免疫反应，影响细胞发育和分化。

1.2 MTHFR与非综合征性唇腭裂

非综合征性唇腭裂是指不伴有任何其他发育畸形的唇腭裂，占所有唇腭裂发病数量的70％。非综合征性唇腭裂在各种族的发病率有所不同，亚洲黄种人及美洲印第安人群中最高，白种人次之，黑人发病率最低。在我国，非综合征性唇腭裂发病率大约为1.42/1000。叶酸是颌面部发育的必要因素，而MTHFR突变后可导致叶酸代谢过程中亚甲基四氢叶酸还原酶功能的缺失使得叶酸浓度下降，从而增加胎儿罹患非综合征性唇腭裂的概率。

1.3 MTHFR与男性不育

Hcy具有细胞毒性，可以使巯基氧化，细胞内产生大量氧自由基，导致精子线粒体和核DNA损伤，最终引起精子功能受损。同时有研究认为Hcy可抑制谷胱甘肽合成，破坏精液中活性氧产生与清除的动态平衡，影响精子功能。另有研究表明，高Hcy血症可引起睾丸中的血管过早发生动脉硬化，影响睾丸的血液供应，导致生精功能障碍。叶酸是一种抗氧化剂，当体内呈高Hcy水平时，如果摄入叶酸减少，体内无足够的叶酸来抵制高Hcy产生的氧化应激，可致精子DNA受损，影响生育功能。

1.4 MTHFR与复发性自然流产、早产

早产是常见的妊娠并发症，占分娩总数的5％～15％。约有15％的早产儿在新生儿期死亡，占新生儿死亡的70％以上。存活的早产儿中10％～30％留有远期的智力发育障碍或神经系统的后遗症。MTHFR突变会使Hcy代谢受阻，在体内积聚引起高同型半管氨酸血症。高同型半管氨酸血症与多发性流产、子痫前期、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎有关，且与早产密切相关。在影响Hcy代谢的关键酶中，MTHFR最为受到研究重视。这是由于MTHFR存在基因突变会降低酶的活性，是造成Hcy浓度升高的重要遗传因素。