[发明专利]EB病毒编码的microRNA BART10的应用方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种用于检测鼻咽癌石蜡包埋样品中EB病毒编码的microRNABART10(EBV-miR-BART10)表达水平与鼻咽癌复发和转移关系的原位杂交探针、检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma,NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿瘤，由于发病部位隐蔽，难于早期发现，且极易发生转移，初诊患者颈部淋巴结转移率高达80％。放射治疗是目前鼻咽癌临床上最常用的治疗手段，60～70％的患者能取得较好的疗效，但仍有20～30％的患者会出现复发和转移。复发和转移是临床上导致鼻咽癌患者死亡的主要因素之一，且放化疗对治疗鼻咽癌的复发、转移效果不理想，因此，筛选新的鼻咽癌早期诊断及预后判断的分子标记物，对于鼻咽癌的临床治疗有着重要的指导意义，同时相比较传统的放化疗手段，生物治疗的方法更适合复发和转移鼻咽癌的治疗，其中基因疗法对防治鼻咽癌的复发、转移具有更重要而广阔的临床应用前景，筛选鼻咽癌基因治疗的靶点也同样意义重大。

鼻咽癌的发病与EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)感染密切相关。EB病毒是一种普遍存在的人类疱疹病毒，可以感染全球95％左右的成人人口，除偶尔有一小部分人也会引起传染性的单核细胞增多症外，大部分被感染者不会出现任何的临床症状，绝大多数情况下EB病毒可以在宿主体内长期潜伏感染。然而，在某些情况下潜伏感染的EB病毒会导致恶性肿瘤的发生，包括B细胞来源的伯基特和何杰金氏淋巴瘤，以及上皮细胞来源鼻咽癌和胃癌等。EB病毒导致恶性肿瘤发生的机制目前尚未完全明了，可能与EB病毒本身编码一系列基因的表达有关，如EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LatentMembraneProtein1，LMP1)作为一种致瘤蛋白，能激活许多宿主细胞内癌基因的表达，抑制抑瘤基因的结构和功能。

EBV作为双链DNA病毒其基因组大小约为170kb，除了可转录一系列蛋白编码基因，最近发现EB病毒还可编码一类微小RNA(microRNA，miRNA)分子，目前已发现EBV可编码25个miRNAs前体，加工成44个成熟的miRNAs，且EBV编码的miRNAs在EBV基因组上成簇分布，可以分为BART和BHRF1两组。EB病毒编码的miRNAs可能通过调控EB病毒本身编码的基因或者宿主细胞内的基因，从而参与了EBV介导的鼻咽上皮恶性转化，影响鼻咽癌的发生发展。然而鼻咽癌中对于EBV编码miRNAs的研究还不是很透彻，44个成熟的EBVmiRNAs中大部分还没有功能研究的报道，比如有关EBV-miR-BART10的作用及机制的研究就很少。迄今为止有关EBV-miR-BART10与鼻咽癌发生发展中的作用的关系及其在鼻咽癌病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报道。我们通过研究表明，EBV-miR-BART10在鼻咽癌组织中的表达显著升高，高表达EBV-miR-BART10的鼻咽癌患者比低表达EBV-miR-BART10的鼻咽癌患者更容易发生复发和转移，预后更差，因此，针对EBV-miR-BART10设计专用原位杂交探针及检测试剂盒，用于检测鼻咽癌组织中EBV-miR-BART10的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进行复发和转移的预测提供参考。此外，并非所有的EBVmiRNAs高表达时更容易发生复发和转移，预后更差，即成正相关；申请人同时研究了多种其它EBVmiRNAs的表达与复发和转移的关系，例如：EBER-1在正常鼻咽上皮中不表达或低表达，而在鼻咽癌组织中表达上调，但鼻咽癌组织中高表达EBER-1的患者比低表达EBER-1的患者不容易发生复发和转移，预后更好，即成负相关。说明EBVmiRNAs的表达与复发和转移的关系，不能推测。

我们在鼻咽癌细胞中转染人工合成的EBV-miR-BART10，证实在EBV阴性的鼻咽癌细胞株中过表达EBV-miR-BART10可以促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；通过设计并合成靶向EBV-miR-BART10的反义寡核苷酸，证实反义寡核苷酸可以有效抑制EBV-miR-BART10的表达，并可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力；将EBV-miR-BART10的反义寡核苷酸负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护EBV-miR-BART10的反义寡核苷酸免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。

发明内容