[发明专利]CIK的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CIK的制备方法。

背景技术

CIK(cytokine-inducedkiller，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞)是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一群异质细胞群，其中CD3+，CD56+淋巴细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；诱导肿瘤细胞凋亡；通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK具有杀瘤活性高、杀瘤谱广、对正常组织毒性低、体外可高度扩增等特点，在临床细胞免疫疗法中是常用的细胞。

然而，现有的CIK制备方法是在培养瓶等2D环境下联合使用多种细胞因子诱导培养，该培养方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷。

发明内容

为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷，本发明公开了一种CIK的制备方法，在CIK的培养体系中添加纤维蛋白凝胶，以更好地模拟体内细胞生长的三维微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，显著增加细胞的扩增倍数，获得的细胞活性更强。

实现上述目的技术方案是，本发明开发出的一种CIK的制备方法，

该方法包括如下步骤，

获取单个核细胞，将所述单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合，再对单个核细胞进行诱导培养成CIK。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*10²-10⁶个/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述纤维蛋白凝胶的制备过程为：

取抑肽酶溶解纤维蛋白原，获得溶液A；将凝血酶加入可溶性钙盐溶液中，获得溶液B；将溶液A和溶液B混合，即得到纤维蛋白凝胶。

在本发明提供的CIK的制备方法中，可溶性钙盐溶液为CaCl₂溶液，且CaCl₂溶液的浓度为30-50mmol/L。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述溶液B中凝血酶的浓度为250-400U/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml；所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为1.5～3.5g/L。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合后的诱导培养过程为：

将单个核细胞与纤维蛋白凝胶置于含有抗CD3单克隆抗体和RetroNectin预包被的培养器皿中，并加入含PPP和IFN-γ的培养基进行培养；

再添加生长因子IL-1α和IL-2继续培养至单个核细胞转化成CIK。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为10-150ng/ml，RetroNectin的浓度为10-50g/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述培养基中PPP的体积分数为0.5-2％，IFN-γ的浓度为500-1500IU/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述IL-1α在培养基中的浓度为50-150IU/ml，IL-2在培养基中的浓度为100-500IU/ml。

本发明的有益效果是：培养CIK时通过加入纤维蛋白凝胶，能够模拟体内细胞生长的三维环境，为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，从而更有利于CIK的生长，可显著增加CIK的扩增倍数，获得的细胞的活性更强。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为通过本发明提供的CIK制备方法实施例1所获得细胞分布图；

图2为通过现有的CIK制备方法所获得的细胞分布图。

具体实施方式

为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的现象，本发明在CIK的培养体系中添加纤维蛋白凝胶，以更好地模拟体内细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，经该方法制备CIK，可显著增加CIK的扩增倍数，获得的细胞活性更强。

具体地，本发明提供的一种CIK的制备方法，包括如下步骤：