[发明专利]一种检测新城疫病毒的环介导等温扩增试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一套用于病毒快速检测的引物组、试剂盒及使用方法，尤其涉及一套用于检测新城疫病毒的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其使用方法，属于新城疫病毒检测领域。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)，又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟，是一种由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的以呼吸道和消化道黏膜出血为特征性病变的烈性传染病。ND具有高度接触传染性，传播速度极快，急性发病时病死率接近100％，严重危害家禽养殖业，故世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病之一。

新城疫病毒属副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)，病毒粒子外有囊膜，囊膜表面有纤突，其基因组为一长约15kb的单股负链RNA。NDV的基因组不分节段，编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)以及具有RNA依赖性的RNA聚合酶蛋白(L)。P、NP和L称为内部蛋白，与病毒RNA组成核糖核蛋白体(RNP)；M、F和HN则称为外部蛋白。

HN蛋白是一种既有血凝素(HA)活性，又有神经氨酸酶(NA)活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保护性抗原。HA活性能够使病毒吸附到对应靶细胞的受体上，NA活性则破坏细胞受体，从感染细胞表面释放病毒粒子。同时HN蛋白还能够促进膜融合，吸引F蛋白充分接近该位点，继而启动病毒与细胞膜融合。HN蛋白mRNA的5’非编码区(UTR)是NDV毒力的影响因子之一，若将其缺失，NDV复制不会受到影响，但却可以降低病毒的致病力。此外，若HN蛋白第526位氨基酸发生突变，HN蛋白的活性将会减弱，NDV的复制将会受其影响，致病力降低。HN蛋白N末端胞内区的5个氨基酸位点(第1、2、3、4、6位)对病毒与细胞的融合、病毒毒力以及HN蛋白和M蛋白的定位有着极其重要的作用。这一系列研究表明，病毒的组织嗜性依赖于HN蛋白，HN是NDV致病力的必需因子，与F基因共同决定着NDV的毒力强弱。

环介导等温扩增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士发明的一种新的核酸扩增技术。其基本原理在于利用4-6个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下对靶序列进行扩增。RT-LAMP技术具有特异性强、敏感性高、反应迅速、设备要求低等特点。该方法经过十几年的发展，得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。本发明建立了一套新城疫病毒HN基因环介导等温扩增试剂盒及检测方法，为家禽新城疫病毒的检测及调查分析提供了一种新的简便、快速的途径。

发明内容

本发明的主要目的是提供一套用于新城疫病毒HN基因快速检测的环介导等温扩增引物组，由HN基因环介导等温扩增引物组构成，可用于检测新城疫病毒的环介导等温扩增反应。

所述新城疫病毒HN基因环介导等温扩增引物组是通过大量比对Genbank中下载的不同亚型新城疫病毒的HN基因核酸序列，针对保守区片段序列所设计。其中，HN基因引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，内引物与外引物按6∶1-12∶1的比例配制成，优选比例为8∶1，环引物与内引物的比例为1∶2。

所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒Isothermal Master Mix或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO₄和缓冲溶液组成，及逆转录酶如AMV reverse transcriptase或者等效的其他逆转录酶构成。试剂盒中还同时引入一组新城疫病毒阳性质控品和阴性质控品。所述新城疫病毒阳性质控品，可以是由新城疫病毒人工合成片段构建的重组质粒、体外转录RNA或新城疫病毒LaSota株提取的总RNA；所述阴性质控品，为不含新城疫病毒基因组片段的介质。

所述新城疫病毒HN基因环介导等温扩增反应体系的总体积为25μL，其中包括HN基因环介导等温扩增引物组溶液6μL，环介导等温扩增反应预混液14μL，待测试样或者阴性质控品各5μL；环介导等温扩增荧光检测系统的扩增程序为：①65℃，30min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。