[发明专利]一种检测新城疫病毒的环介导等温扩增试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一套用于新城疫病毒检测的环介导等温扩增引物组，由血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)基因环介导等温扩增引物组构成，其特征在于，可用于检测新城疫病毒的环介导等温扩增反应；

所述新城疫病毒HN基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，由一对外引物(SEQ No.1、SEQ No.2)、一对内引物(SEQ No.3、SEQ No.4)和一对环引物(SEQ No.5、SEQ No.6)组成，其引物序列为：

2.如权利要求1所述的新城疫病毒HN基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，用于新城疫病毒检测的方法包括：1)实时荧光检测法，其特征在于，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，进而判定检测结果；2)实时浊度检测法，反应时实时监测反应管中浊度信号，获得等温扩增曲线，进而判定检测结果；3)紫外照射荧光检测法，扩增反应后将反应管中反应液在紫外光下照射，呈红色荧光的检测为阳性结果，不呈红色的检测为阴性结果；4)直接荧光目测法，其特征在于，在扩增反应前向反应管中加入钙黄绿素作为荧光指示剂，可通过肉眼直接判定结果，反应管中反应液呈绿色的为阳性结果，不呈绿色的为阴性结果；5)凝胶电泳检测法，其特征在于，反应后反应液电泳时有特征梯形条带者为阳性结果，无特征梯形条带者为阴性结果；6)微全分析法或者微流控芯片法或者芯片实验室法，其特征在于，样品裂解、核酸提取纯化、等温扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，结果判定方法包括前述的实时荧光检测法、实时浊度检测法、紫外照射荧光检测法、直接荧光目测法、凝胶电泳检测法，该微全分析系统由微膜片泵(阀)驱动，通过程序控制微膜片泵(阀)的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。

3.一种用于新城疫病毒检测的试剂盒，其特征在于，主要由如权利要求1所述的新城疫病毒HN基因环介导等温扩增引物组溶液及环介导等温扩增反应预混液、新城疫病毒阳性质控品和阴性质控品构成，采用实时荧光检测方法进行新城疫病毒的快速检测；

所述新城疫病毒HN基因环介导等温扩增引物组溶液，其特征在于，是由一对内引物、一对外引物和一对环引物按一定的比例配置而成，其中内引物与外引物按6∶1-12∶1的比例配制成，优选比例为8∶1，环引物与内引物的比例为1∶2；

所述环介导等温扩增反应预混液，其特征在于，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO₄和缓冲溶液及逆转录酶如AMV reverse transcriptase或者等效的其他逆转录酶构成，包括可使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒Isothermal Master Mix或者等效的其他试剂盒；

所述新城疫病毒阳性质控品，其特征在于，可以是由新城疫病毒人工合成片段构建的重组质粒、体外转录RNA或新城疫病毒LaSota株提取的总RNA。所述阴性质控品，其特征在于，为不含新城疫病毒基因组片段的介质。

4.如权利要求3所述的新城疫病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，在HN基因环介导等温扩增反应管内分别加入相应环介导等温扩增引物组溶液6μL，环介导等温扩增反应预混液14μL，待测试样、阳性质控品或者阴性质控品各加入5μL，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，所述荧光检测系统的扩增程序为：①65℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。

5.如权利要求3所述的新城疫病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，扩增结果的分析和判定方法包括：

1)环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线出现平台时，其荧光值高于本底噪音信号5倍且溶解曲线为单一尖锐峰的判定为阳性结果，其荧光值高于本底噪音信号5倍但溶解曲线不是单一尖锐峰的判定为非特异性的交叉干扰信号；其荧光值低于或等于本底噪音信号5倍的判定为阴性结果；

2)当待测试样HN基因环介导等温扩增反应管全部为阴性结果时，则未检测到新城疫病毒；待测试样为阳性结果，则有新城疫病毒感染；HN基因的扩增曲线以15min时的读数为基准。

6.如权利要求3所述的新城疫病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，实时荧光检测中每个反应荧光信号达最大值所对应的扩增时间与模板RNA稀释比的对数值之间，在稀释比为1∶10-1∶100000范围内具有线性关系，R²＞0.995，方法检出限可达1∶100000新城疫病毒模板RNA。