[发明专利]一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法

说明书

技术领域

本发明属于真菌培育技术领域，具体涉及一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法。

背景技术

紫杉醇是目前最好的抗癌化疗药物，尤其是对乳腺癌、子宫癌和卵巢癌等女性高发癌症，然而由于其人工合成工艺复杂，价格奇高，因此，该药品主要提取自红豆杉，然而红豆杉的紫杉醇含量极低，且该种植物生长极其缓慢，因此，通过巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III人工半合成获得紫杉醇是目前该药品的主要途径。尽管红豆杉中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III含量较之紫杉醇高，但依然不能满足市场需求，因此导致紫杉醇价格依然昂贵，不能充分满足市场需求。因此，如何快速生产巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III成为影响紫杉醇市场价格的主要因素。

近年来，提取自红豆杉的一些内生菌被发现能够产生巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III，这为通过发酵手段生产紫杉醇半合成原料提供了现实基础，但是，相比较红豆杉中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III的含量，内生菌发酵所产生的较低，因此，如何通过适当的手段来提高其发酵产量成为这些内生菌能否应用到生产的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法，解决了现有技术中存在的原内生菌发酵后10-去乙酰巴卡廷III产量低的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法，包括以下步骤：在培养基中培养木霉Trichodermasp.菌株IRB54，当菌丝体发酵培养3天后，进行循环培养，对得到的培养液进行提取分离，得到10-去乙酰巴卡廷III。

本发明的特点还在于，

培养基为PDB培养基，其组成为：水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH6.5-7.0。

在培养基中培养3天条件为：在25℃条件下培养摇床转速为230r/min-250r/min。

循环培养条件为：低温10℃培养6小时，25℃培养12小时，30℃培养6小时，循环培养的循环次数12次，即12天。

10-去乙酰巴卡廷III提取分离的的步骤包括：

1)、培养液透过四层纱布过滤，过滤液置于70℃低压旋转蒸发器中进行蒸馏，当液体剩余10ml时，置于体积比为3:2的氯仿/甲醇混合液，并充分混合，备用；

2)、过滤后菌丝体残渣被加石英砂充分研磨，然后将研磨残渣在50℃烘箱中充分干燥，将干燥后的残渣置于体积比为3:2的氯仿/甲醇混合液充分混合，在40℃超声波30分钟，备用；

3)、将1)中的氯仿/甲醇混合液在45℃的条件下进行真空旋转蒸馏除去氯仿和甲醇，获得膏状提取物；

4)提取物被再次溶解在30ml的氯仿中，然后用30ml的水进行抽提，有机相氯仿在40℃条件下通过旋转蒸发被蒸发，产生干燥提取物，即为10-去乙酰巴卡廷III粗提物；

5)该干燥提取物被溶解在5ml的甲醇中，并通过0.45lm的滤膜过滤，过滤后提取物溶液备用于高效液相检测；

6)对菌丝体残渣提取物的氯仿/甲醇混合液，重复步骤1)-步骤5)提取的10-去乙酰巴卡廷III。

本发明的有益效果是：本方法通过温度循环的物理方法来提高内生菌产10-去乙酰巴卡廷III的产率，方法简单且不增加任何投资。本方法通过温度循环方法来提高内生菌发酵产物，和一般化学方法相比能减少有含化学物对发酵产物的污染，减少提取纯化成本。

本发明通过温度循环法来进行一株产10-去乙酰巴卡廷III的培养，使其10-去乙酰巴卡廷III的产量显著提高，达到原来对照产量的2.4倍。

附图说明

图1是木霉Trichodermasp.菌株IRB54的菌落图和孢子及其孢子梗图。

其中，A)是菌落图；图B是菌落分生孢子及其分生孢子梗。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法，包括以下步骤：

在培养基中培养木霉Trichodermasp.菌株IRB54，当菌丝体发酵培养3天后，进行10℃6小时，25℃12小时，30℃6小时循环培养，使菌株IRB54的生长受到高低温的刺激，从而增加真菌次生物质的产量。

其中，培养基为PDB培养基，其组成为：水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH6.5-7.0；