[发明专利]一种快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法

说明书

本发明公开了一种快速测定N1、N2亚流感病毒的方法，本发明采用一步法荧光定量RT‑PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混成2X one‑step buffer，将多种酶配比进行混合，使本发明的操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染，本发明操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1和N2鉴别检测荧光定量RT‑PCR试剂盒，用于N1和N2亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种鉴别流感病毒不同亚型的方法，具体涉及一种利用多重荧光定量PCR方法快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法。

背景技术

流感病毒（Influenza Virus）属正粘病毒科，为RNA病毒。根据病毒膜蛋白（M）和核蛋白（NP）的差异，将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三个大型。其中A型流感的流行时间最长，危害最大，流行宿主范围也最广。根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的结构及其基因特性的不同，又可分为不同亚型。目前A型流感病毒已发现的血凝素（HA）有16个亚型，分别用H1、H2 …H16来表示；神经氨酸酶有9个亚型，分别用NI、N2 …N9来表示。各亚型间的HA和NA交叉组成不同的亚型毒株，如H1N1、H5N2、H5N1、H9N2等。各亚型的基因序列有所不同，病毒特性和抗原性等亦有所不同。其中H5N1、H5N2、H9N2亚型禽流感病毒是目前感染肉鸡、蛋鸡的最常见的亚型，引起鸡群高死亡率的是H5N1、H5N2亚型，H9N2亚型的死亡率较低。因此根据临床鸡群发病死亡情况结合检测N1、N2亚型流感病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，使我们能在极短的时间内判断鸡群是由哪种亚型的病毒引起的感染，为临床预防治疗禽病提供理论基础。

流感病毒容易变异，变异形式有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围等方面的变异，但最主要的是抗原性变异。抗原性变异主要是表面抗原HA和NA易变异。流感病毒表面抗原变异幅度的大小，直接影响到病毒传播的能力。若变异幅度小，属于量变，称为抗原漂移。如果抗原变异幅度大，属于质变，称为抗原性转变，形成新的亚型，危害一般较大，往往引起较大的流行，甚至世界性流行。如甲型流感病毒的HA、NA基因容易发生抗原转变，导致HA和NA的部分或大部分氨基酸发生改变，出现抗原性完全不同的新亚型。

流感病毒的检测主要依靠实验室进行确切诊断，常规的诊断方法主要包括血清学检测及病原的分离鉴定两方面。病毒的分离是诊断该病最常用的方法之一，通常采用鸡胚接种分离流感病毒，经培养后的病毒经过血凝(HA)及血凝抑制(HI)实验，可初步鉴定出流感病毒。但是病毒分离无论是鸡胚接种还是细胞分离都存在周期过长、不能准确区分病毒亚型、准确性和敏感性差的问题。

随着分子生物学的飞速发展，分子生物学技术已广泛应用于流感病毒的测定。尤其是近年来快速发展的荧光定量RT-PCR方法。荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。反转录和PCR扩增又在同一管内完成， 有助于减少操作污染，时间更短、灵敏度更高。在实时荧光定量PCR反应中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度的变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。最常用的探针是Taq Man 探针，该探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。其序列与目标序列上游引物和下游引物之间的序列高度配对。其中，荧光基团连接在探针的 5’末端，而淬灭基团则在 3’末端。常用的荧光基团有FAM、TET、VIC、HEX等。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光基因与 3’端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离。这样随着扩增循环数的不断增加，释放出来的荧光基团也在不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

目前，荧光定量PCR检测被广泛应用于病原微生物检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。