[发明专利]一种筛选G-CSF（15-75）多肽的巴斯德毕赤酵母培养基

说明书

本发明公开了一种筛选重组G‑CSF多肽(15‑75)表达的巴斯德毕赤酵母培养基。该培养基不含酵母粉和蛋白胨，含有微量元素，可用于筛选分子量为6.5KD的G‑CSF多肽(15‑75)，避免了酵母粉和蛋白胨对G‑CSF多肽表达鉴定的影响。

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种用于筛选重组G-CSF(15-75)多肽表达的巴斯德毕赤酵母培养基。

背景技术

粒细胞刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的主要作用是刺激中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化，增加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能。重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)于1991年首先在美国上市，迄今广泛应用于临床预防和治疗多因素引起的中性粒细胞减少症及其并发症(如发热、感染等)。G-CSF主要作用于中性粒细胞系造血细胞的分化、增殖和活化。化疗后肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。在体外，G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞功能，如促进ADCC、超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。

蛋白多肽分子量相对较小，稳定性好，穿透力强，避免宿主免疫应答，易于吸收等特点受到广泛关注。Facchiano研究发现bFGF的48-58个氨基酸的肽段(PHIKLQLQAE)对于bFGF本身的二聚化具有重要作用，可以抑制bFGF介导的血管新生。成熟的人G-CSF 有174个氨基酸，分子量为19.6KD，PI为6.1，对酸碱(pH2-10)、热及变性剂稳定，有5 个半胱氨酸残基，Cys36与Cys42，Cys74与Cys64间形成二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于蛋白活性有重要作用。John F.Reidhaar-Olson研究认为G-CSF的Leu15、 Glu19、Lys34、lys40、Val48、Leu49对于G-CSFR的二聚化，维持细胞活性具有重要作用。本发明人选取人G-CSF多肽(15-75)进行研究，发现其具有G-CSF同样的生物学活性，促进 NFS-60细胞增殖。

巴斯德毕赤酵母是一种单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作，应用也最为广泛。Invitrogen公司开发了成熟的载体系统和培养基体系用于基因工程重组蛋白的酵母表达。采用BMGY/BMMY培养基系统，可高效的表达大多数的重组蛋白，BMGY和BMMY 培养基主要成分有酵母提取物，蛋白胨，无氨基酵母氮源等，富含氨基酸、核苷酸、糖类、维生素和多肽，为酵母的生长提供碳源和氮源，但其中含有多种蛋白成分，特别是在电泳时在6.5KD左右电泳条带明显，重组表达蛋白和培养基蛋白无法区分。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种改良型BMG/BMM培养基，所述培养基有效的解决了传统的BMGY和BMMY培养基中的酵母粉和蛋白胨对于蛋白表达鉴定的影响。

本发明所述的培养基含有以下组份：

改良BMG培养基：1.34％～1.5％YNB，4×10^-5％～5×10^-5％生物素，0.5％～5％甘油，0.05～0.2M钾盐，0.5％～1％PTM1微量元素溶液；

改良BMM培养基：1.34％～1.5％YNB，4×10^-5％～5×10^-5％生物素，0.5％～1％甲醇， 0.05～0.2M钾盐，0.5％～1％PTM1微量元素溶液；

PTM1微量元素溶液：五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，硫酸锌20.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸0.09M/L。

优选地，所述培养基含有以下组份：