[发明专利]一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产品精深加工领域，具体涉及一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法。

背景技术

鱿鱼是重要的海洋头足类水产物，广泛分布于大西洋、印度洋和太平洋各海区。近年来，我国鱿鱼捕获量连年增加，鱿鱼加工已成为国内水产品加工的主要组成部分之一。一般来说，鱿鱼经解冻加工后有30％左右的头、足、内脏及表皮等废弃物产生。从世界范围来看，每年100多万吨鱿鱼捕获量将会产生25～30万吨的鱿鱼废弃物。对这些废弃物，一般处理方法是就地掩埋或者加工成鱼粉，这不但对渔业资源造成浪费，而且还存在环境污染。

随着现代海洋加工业和养殖业的发展，鱼油废弃物的综合利用越来越受到重视。国外有研究发现，占鱿鱼废弃物总量8～13％的鱿鱼皮中含有丰富的蛋白质资源，蛋白质含量约占鱿鱼皮干重的88％左右。其中以胶原蛋白为主，含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生物活性肽。对于鱿鱼肝脏的利用，在国外，如西班牙、日本采用自身酶解发酵法生产鱿溶浆、鱿鱼粉等作为鱼类饲料。鱿鱼肝脏在我国生物废弃物中占有很大的比例，解决鱿鱼肝脏的处理问题，最佳方式是再加工利用。目前，国内仅有鱿鱼肝脏干粉的加工，并且是用作饲料，技术水平不高，对于鱿鱼肝脏的利用研究还有比较大的发展空间。

中国专利公告号CN102250994A，公告日2011年11月23日，公布了一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，包括将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白用丙酮处理除脂，选用胃蛋白酶在水解温度35～38℃，pH为1.5～2.5，酶与底物的比为2～3％，底物浓度为1～3％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白18～25h；将酶解液进行超滤处理后，跟踪其ACE抑制活性，应用凝胶过滤层析、DEAE阴离子交换柱、RP-HPLC等方法分离纯化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在温度2～100℃、pH在1～12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定，而且模拟胃肠消化实验对组分的ACE抑制活性的影响不大，经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。该发明采用生物酶法利用鱿鱼肝脏制备ACE抑制肽，具有安全性高、反应条件温和以及环保等优点。但是该发明只采用了单酶酶解鱿鱼肝脏，目前对于采用混合蛋白酶制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的研究尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法，为制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽提供更多的选择途径，以解决目前鱿鱼肝脏加工利用率低造成鱿鱼资源浪费的问题。

本发明的具体技术方案为：一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法，包括如下步骤：

(1)鱿鱼肝脏预处理：将鱿鱼肝脏绞碎与水按质量比1:1～1:1.5混合，在35～50℃下加入6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7～9，保温20～30min，然后升温至70～90℃，反应1～1.5h，加入占肝脏重量2～4％的氯化钠，盐析5～15min，以4000～10000r/min离心15～30min，去掉上层鱼油，得到粗制的鱿鱼肝脏蛋白；

(2)鱿鱼肝脏蛋白脱脂：将粗制的鱿鱼肝脏蛋白脱水后，按料液比1g:3mL加入正己烷和异丙醇的混合液洗涤2～3次，真空干燥得到脱脂鱿鱼肝脏蛋白；

(3)混合酶酶解：将脱脂鱿鱼肝脏蛋白配成质量分数为3～5％的水溶液，调节pH6.5～7.5，加入占脱脂鱿鱼肝脏蛋白质量1～6％的混合蛋白酶，在40～65℃的水浴锅中水解10～18h，所述的混合蛋白酶由复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；

(4)酶灭活：酶解结束后，以100℃水浴加热10～20min，使酶失活；

(5)离心：失活的酶解液在4000～10000r/min条件下离心20～40min，取上清液，冷冻干燥，冻干的粉末即为鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽。

不同的蛋白酶对蛋白质的作用位点不同，单种酶水解作用位点较单一，导致蛋白质水解度低，本发明采用复合蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶混合作用于鱿鱼肝脏蛋白，可以提高鱿鱼肝脏蛋白的水解度，获得分子量更低的活性肽。同时由于复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适温度和最适pH比较接近，协同效果会更好。

作为优选，所述步骤(2)中正己烷和异丙醇的体积比为4:3。正己烷和异丙醇的混合液可以有效脱去粗制的鱿鱼肝脏蛋白中的脂类，获得纯度更高的鱿鱼肝脏蛋白。

作为优选，所述步骤(3)中，复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量分数分别为35～40％、35～40％、20～30％。