[发明专利]一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术。

背景技术

异尖科线虫是鱼类寄生线虫中最大的科,成虫寄生在海洋哺乳动物的体内,幼虫寄生在鱼类或软体动物中,人食入含有活的某些异尖科线虫幼虫的食物,可引起异尖线虫病。

随着吃海鲜、海产加工品等饮食时尚的兴起和渔业、旅游业的发展，异尖线虫作为海产食品中的一种重要的食源性寄生虫病，对人们生命健康存在在着巨大威胁。不仅活的异尖线虫虫体可以引起异尖线虫病导致急腹症和过敏症，引发荨麻疹过敏性反应，严重的可引起死亡案例。由于异尖线虫虫体中含有许多耐热性、耐胃蛋白酶活性的过敏原，经高温和胃液处理的死亡虫体也可以引起过敏反应。Shimakura用凝胶过滤，快速液相色谱和反相高效液相色谱法异尖线虫幼虫中提纯纯化出1种分子量为21kDa的热稳定性过敏原，7/8的病人对其有过敏反应。Moneo在异尖线虫幼虫E/S蛋白质中提取出了一种分子量为9kDa的热稳定性过敏原，将其加热后，一些病人仍然对其有反应。因此即使食用了经过高温处理的含有虫体成分的鱼或罐装产品也会出现过敏性症状。

2006年Armentia等报道了一起人由于食用鸡肉造成的异尖线虫过敏症的病例，由于现在的食品加工业用到的鱼粉是在高温下制作的，说明此病例是由于耐热性的过敏原引起的。

异尖线虫在海产鱼类和头足类等中普遍存在，寄生于内脏和肌肉之中。由于异尖线虫虫体颜色较鱼肉相近，在鱼类和头足类肉制品加工中极有可能混入鱼肉原料，经过高温煎炸加工制成各种各样产品，如鱼糜、鱼罐头、鱼丸、鱼肉排、鱼肉肠、腌制鱼、烟熏鱼等产品。但因为这些产品中含有异尖线虫虫体过敏原，所以食用这些产品极大可能导致过敏症发生。

我国东接渤海、黄海、东海、南海四大海域，海洋渔产丰富，海岸线上人群密集，且居民素有食用海洋食品品的习惯，海产品及其加工品消费量巨大，其健康安全与否危及千家万户，由于其异尖线虫虫体成分所引起的过敏性症状和其他症状非常相似，单凭临床诊断较为困难，而且也极易引起误诊和漏诊。

发明内容

本发明的目的在于为了解决现有由于异尖线虫虫体成分所引起的过敏性症状难以确诊的缺陷而提供一种高质量的异尖线虫虫体成分检测方法可以降低异尖线虫传给人类的风险一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术，包括如下步骤：

a)对异尖线虫DNA提取；

b)引物设计：

上游引物ANISAKIS COI F:5’—GGKCYATTAAYTYTATRACWACTAC—3’(SEQ ID NO.1)

下游引物ANISAKIS COI R5’—AAAGAWGTATTMARRTTACGRTCVG—3’(SEQ ID NO.2)

退火温度为54.5℃，预期扩增片段大小为178bp；

c)对步骤b)的引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶上电泳，观察结果；

d)分别进行特异性试验、敏感性试验进行验证。

作为优选，步骤a)中DNA提取是将甘油中保存的异尖线虫用蒸馏水洗净后，应用Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒进行DNA的提取。

作为优选，步骤c)中PCR反应体系各试剂加入量为：10×PCR buffer 2μL、dNTP1.6μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、DNA模板1μL、ddH₂O 14μL、Taq酶0.1μL，总体积20μL。

作为优选，扩增程序：94℃5min→94℃30sec，54℃30sec，72℃1min，30个循环→72℃10min。应用设计的引物对异尖线虫DNA进行PCR反应。

作为优选，特异性试验为以简单异尖线虫代表异尖科线虫，提取DNA，分别用颚口线虫、捻转血矛线虫和鱼肉DNA作对照，按步骤b)与c)的PCR检测方法进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析结果。

作为优选，敏感性试验是以3.6ng/μL的简单异尖线虫DNA为模板，连续十倍浓度梯度稀释，稀释次数为8次，将不同浓度的DNA进行PCR扩增，电泳分析结果。

作为优选，鱼肉取自带鱼、马鲛鱼、鲭鱼、秋刀鱼、竹荚鱼、黄鲇鱼、黑线鳕鱼、黑鲷鱼与黑盲鳗。

本发明的有益效果：