[发明专利]检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，用于亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的快速检测。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）是细胞内叶酸平衡和代谢的关键酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的条件下不可逆催化5-甲酸基四氢叶酸合成5-甲基四氢叶酸，后者参与DNA的合成与甲基化作用。MTHFR基因存在的C677T多态性，使得MTHFR的活性降低。在使用甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶的活性时，如果患者存在该变异，将造成严重的毒副反应。因此MTHFR基因多态性的检测对于个体化合理用药具有重要的指导意义。

缺血性脑卒中是老年人群中较为常见的一种脑血管疾病，其致残率和致死率高，特别是在合并有高血压、糖尿病等危险因素的情况下，其发病率更高，给社会和家庭带来巨大负担。近年来，我国缺血性脑卒中发病有年轻化趋势，青中年人群发病率明显增加。已有研究证实，同型半胱氨酸（Hcy）升高已经成为缺血性脑卒中的重要指标，而MTHFR 的677位点C→T的突变，使得MTHFR产生热不稳定性缺陷，Hcy升高，因此，MTHFR C677T多态性是青年缺血性脑卒中的独立危险因子，当个体携带有风险等位基因时，脑卒中的发病率将比普通人升高。当然，脑卒中等心脑血管疾病是遗传与环境因素相互作用的结果，通过改变饮食结构、运动方式、生活习惯，可以延迟甚至避免疾病的发生，因此MTHFR C677T多态性的检测能够提前预知个体罹患心脑血管疾病的危险程度，这对于脑卒中等心脑血管疾病的发病风险预测和早期预防具有重要意义。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-Taqman MGB（Minor Groove Binder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。

如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。

2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1;14(3):163-9, United States Patent 20120135406]。

3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。

4）PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]。

5）PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15；United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。

6）PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染，而且操作步骤多，费时费力。