[发明专利]甲胎蛋白异质体AFP－L3定量检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及甲胎蛋白异质体AFP－L3定量检测试剂盒及其应用。

背景技术

在世界范围内，肝细胞癌是第最常见的癌症，第三种最常见的癌症相关死亡原因。危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。

甲胎蛋白异质体AFP-L3是糖基化异常的甲胎蛋白，AFP-L3是肝癌细胞所特有，该指标比常见的甲胎蛋白具有更高的特异性，特异性高达95％以上；更重要的是，该指标对于亚临床肝癌的诊断具有重要临床意义；国内临床研究认为该指标至少可以比影象学提前9-12个月检测出肿瘤，美国临床研究认为比影象学提前21个月预警肝肿瘤；甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是美国FDA批准的第一个明确用于肿瘤预警的生物学指标，在临床肝癌早期诊断中发挥了重要作用；甲胎蛋白异质体AFP-L3是由恶化癌细胞特异生成并含有特异糖链的一种甲胎蛋白组分，甲胎蛋白异质体AFP-L3含量达到10％以上，发生肝细胞癌的危险几率就会极端增加，而良性肝病基本不含有此糖链异常的甲胎蛋白组分，该指标可在影像学发现肝癌之前9～12个月被检测出来，有效起到预警作用，对于肝癌诊治具有重要临床价值，被称为新一代肝癌生物学诊断指标。但长期以来，临床却无法开展甲胎蛋白异质体常规检测，原因是快速分离含异常糖链的甲胎蛋白异质体是个世界难题。

AFP-L3是唯一的由得病患者肝脏中癌细胞生成的蛋白。在美国的一项多中心、前瞻性、双盲、长期临床试验中，对该检测方法进行了研究。结果显示AFP-L3升高15％以上的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。根据已有的肝细胞癌肿瘤学实践指南，这些患者肝细胞癌发生率极端增高。

但是长期以来，国内只有少数临床实验室能够测定AFP异质体，只有少数城市能满足临床测定AFP异质体的要求。迄今为止的异质体测定方法，特异性不好，敏感性差，对于技术的要求较高、操作繁琐、试剂昂贵。

专利CN200510108154公开了一种凝集素竞争法测定AFP-L3的定量试剂盒，该试剂盒在准确性、精密度、灵敏度以及特异性方面取得较好效果，但该试剂盒在灵敏度和稳定性上还需改进。专利CN200610112962也公开了一种凝集素竞争法测定AFP-L3的定量试剂盒，但其仍然解决试剂盒的稳定问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种甲胎蛋白异质体AFP－L3定量检测试剂盒，其由甲胎蛋白(AFP)标准品、凝集素溶液、对照液、包被酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。

在本发明的一个实施方案中，所述包被酶标板是由普通甲胎蛋白单克隆抗体包被酶标板而制作的，所述普通甲胎蛋白单克隆抗体可通过商业渠道获得。具体过程为：将上述单克隆抗体用0.05M碳酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。

所述凝集素溶液为：含6μg/ml的扁豆凝集素和0.1mg/ml的氨基三乙酸的30mmol/L的PBS缓冲液，pH值为6.5。

所述辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP单克隆抗体溶液为含1mg/L的HRP标记的AFP单克隆抗体和3％酪蛋白的PBS缓冲液，pH值为6.5。

所述对照液由阴性对照和阳性对照组成，阳性对照通过收集肝癌病人腹水过滤除菌、分装获得，阴性对照通过收集健康正常人血清，过滤除菌、分装获得。

所述辅助试剂包括对照缓冲液、底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，各试剂具体为：

对照缓冲液为30mmol/L的PBS(pH6.5)缓冲液；

底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.5)配制的3％过氧化氢溶液；

显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；

反应终止液为3mol/L硫酸；

清洗缓冲液为30mmol/L的PBS(pH6.5)配制的0.05％吐温20溶液。

另一方面，本发明还提供了检测甲胎异质体的含量的方法，其中包括使上述试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。

更具体地，本发明的检测方法包括下述步骤：

a)抗原-抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别双孔加入50μl阳性、阴性对照血清，或待测血清样品，使用记号笔标记成1、2系列。37℃水浴保温50分钟。洗板操作5次。