[发明专利]一种冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法

权利要求书

1.一种冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法，其特征在于：将采集的杂交鲆精子经超低温冷冻保存，然后将长期超低温冷冻保存的杂交鲆精子经二步水浴解冻，溶解后加入杂交鲆冻精3-5倍体积的稀释液，离心收集沉淀，而后将沉淀与牙鲆卵子进行人工授精；其中，稀释液为NaCl 7g/L和KH₂PO₄1.0g/L和水组成。

2.按权利要求1所述的冷冻保存的杂交鲆精子与牙鲆卵子的回交人工授精的方法，其特征在于：采集繁殖期精子活力85％以上的杂交鲆精子将其与抗冻液按体积比为1：2—1：3的比例在碎冰中轻轻震荡、充分混匀平衡5-6min；而后以-10℃—20℃/min的降温速率降温至-80℃，然后再以-30℃/min降温速率降至-150℃，置于液氮中进行长期超低温冷冻保存，得到长期超低温冷冻保存的杂交鲆精子。

3.按权利要求2所述的杂交鲆冻精与牙鲆回交人工授精的方法，其特征在于：所述抗冻液由抗冻剂和稀释液和添加剂组成；其中稀释液由NaCl和KH₂PO₄和水组成；抗冻剂为丙二醇(PG)；添加剂为葡萄糖和海藻糖；抗冻液为NaCl 7g/L、KH₂PO₄1.0g/L、葡萄糖10g/L、海藻糖10g/L，水1L以及上述各成分体积的9-13％的丙二醇(PG)。

4.按权利要求1或2所述的杂交鲆冻精与牙鲆回交人工授精的方法，其特征在于：所述二步水浴解是将长期超低温冷冻保存的杂交鲆精子先置于35-37℃水浴锅中轻轻摇动90s，然后置于18-20℃的室温下轻轻摇动30s，实现二步水浴解，融解后置于0-4℃的冰盒中保存。

5.按权利要求1所述的杂交鲆冻精与牙鲆回交人工授精的方法，其特征在于：将经二步水浴解冻后杂交鲆冻精与稀释液按体积比1:3-5的比例混合，混合后以300g的离心力离心5min-8min，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积的冻精悬液，放置于0-4℃冰盒，待用。

6.按权利要求1或5所述的杂交鲆冻精与牙鲆回交人工授精的方法，其特征在于：将上述所得冻精悬液与自然海水按体积比为1:40的比例混匀进行激活，激活后注入牙鲆卵子中，轻轻混匀，使牙鲆卵子与杂交鲆冻精充分接触，静置5-10min；然后洗卵，用筛绢网过滤，将收集的受精卵放置于新鲜的海水中冲洗3～5次,冲洗后静置,取上浮卵进行孵化。