[发明专利]一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用。该方法包括如下步骤：1)将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；2)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳杂交产物，确定待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测。该方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性的同时，简化了实验操作且降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修饰、基因功能研究以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。

技术领域

本发明具体涉及一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

基因组定点编辑技术无论是在生物学基础研究，还是诸如基因治疗、生物反应器等生物相关产业中都具有巨大的应用前景。近年来，随着大量物种基因组测序工作的完成，以及人工核酸内切酶(Engineered endonuclease，EEN)的出现，基因组编辑技术飞速发展，逐渐成为科研工作者选择性编辑基因组和研究基因功能的必备工具。

锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代人工核酸内切酶，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合形成的核酸内切酶。到目前为止，ZFN已相对比较成熟并成功应用于大鼠、小鼠、猪、牛等动物。但是，要设计并构建出一个切割活性高、特异性好的ZFNs工作量很大，而且很多基因序列中可能难以找到合适的ZFN靶点，其技术专利被少数几家商业公司控制，使用成本很高，效率相对较低，这些因素大大限制了ZFNs的推广。随之，第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALENs)出现，由于TALEN与ZFN相比构建相对较为简单，编辑效率高，成本低，特异性更高而受到科研工作者的青睐，并迅速应用于小鼠、斑马鱼、猪和牛等动物。2013年，一种全新的人工核酸内切酶，即第三代人工核酸内切酶—(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9,CRISPR/Cas9)出现，与前两代人工核酸内切酶相比，CRISPR/Cas9制作更为简单，成本更低，作用效率更高。

上述三种人工核酸内切酶各有优缺点，但是其作用机制基本一致，即通过特异识别目的DNA序列，对靶标位置的DNA链进行精确切割，从而形成双链断裂(double-strandbreaks,DSB)，诱发细胞内源性的修复机制，通过非同源末端连接修复(non-homologousend joining,NHEJ)或者同源重组修复(homologous recombination,HR)对切口进行修复。在修复过程中，有可能出现片段的删除或者插入、碱基替换、点突变等定点修饰，所以修复的结果可能呈多态性。