[发明专利]一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法和所育菌株

说明书

技术领域

本发明涉及食用菌培育领域，具体涉及一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法和所育菌株。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，是我国传统的重要食药用菌之一，也是卫生部批准的新资源食品，现在称为食品新原料，允许作为食品直接食用。虫草素是蛹虫草生物活性成分中最重要的一种，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、治疗白血病等作用。虫草素价格昂贵，化学合成目前在实验室能够实现，但是由于条件限制不能实现生产，所以目前市场上销售的虫草素主要从蛹虫草培养物中提取分离得到，因此选育高产虫草素蛹虫草菌株能够大大提高虫草素产量，对降低虫草素的价格以及扩大临床应用具有重要意义。

离子束注入诱变技术应用于生物诱变育种领域起源于20世纪80年代，起初主要用于选育水稻、小麦、玉米等农作物，后逐渐应用到微生物菌株选育中，专利文献“低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法及所选育的菌株”(专利号：ZL 201010550775.8)采用氮离子束诱变选育灵芝，获得产量提高15.9％的菌株。专利文献“银耳菌株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株”(专利号：ZL201310228604.7)采用氮离子束诱变选育银耳菌株，得到产量提高13.5％的菌株。虽然离子束注入诱变是本领域的一种已知的技术，已经有文献报道采用离子束注入诱变选育真菌菌株，但是不同种类的微生物对离子束注入诱变能量及剂量的承受能力不同，即使同一菌种的不同菌株之间也仍然存在较大差异，因此对于每一个菌株都有一个最佳诱变剂量范围，在此条件下菌株突变率最高，经过反复诱变才能够获得更多的正突变菌株，这个最佳条件的获得对菌株诱变选育意义重大，而且由于微生物菌株的个体差异是不能照搬应用的，必须经过大量实验优化才能得到。

因此有必要找到一种适合特定蛹虫草出发菌株(蛹虫草菌株CM-3)的氮离子束注入诱变最佳条件，从而筛选得到一种高产虫草素及菌丝体的蛹虫草菌株。

发明内容

本发明的目的是提供蛹虫草菌株选育的新途径，从而获得高产虫草素及菌丝体的蛹虫草菌株资源。

本发明提供了一种N⁺离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法及所育的一株生长速度快、菌丝体产量高且高产虫草素的蛹虫草菌株。

本发明首先提供一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法，包括以下步骤：

1)蛹虫草菌株离子束注入诱变前样品的处理方法优化：

本发明的发明人以北京市辐射中心微生物实验室保存的蛹虫草菌株CM-3为出发菌株，进行氮离子束注入诱变。由于离子束注入诱变是在真空状态下完成的，因此要保证注入前蛹虫草孢子存活率最高才能保证注入诱变效果最佳。首先要研究合适的孢子培养时间，保证孢子活力最强；其次研究合适的溶剂保护孢子在干燥时受到最少的损伤，保证孢子的存活率最高；然后研究孢子悬液稀释浓度对涂布单层菌膜的影响，保证涂布到金属培养皿上的孢子是单层的，能够均匀的接受带电离子的注入；最后研究干燥时间对涂布的孢子存活率的影响。通过对上述条件的优化找到样品制备的最优条件，保证离子束注入诱变前样品的存活率最高。

在本发明中，所述蛹虫草菌株离子束注入诱变前样品的处理方法为：蛹虫草孢子由液体培养获得，将固体菌种在25℃恒温条件下以150r/min的转速摇床培养7d获得液体培养物，用200目细胞筛过滤所述液体培养物得到孢子悬液，以液体培养基为稀释剂稀释100倍获得浓度为3.6×10⁵个/mL的孢子悬液，吸取0.1mL所述稀释后的孢子悬液涂布到金属培养皿上，无菌风吹干后在2-8h内做离子束注入诱变；本发明的发明人通过大量实验发现经过此条件下能保证蛹虫草孢子的存活率最高。

2)在真空度为10^-3Pa条件下，采用连续注入方式对金属培养皿上的蛹虫草孢子进行N⁺离子束注入诱变，能量为30kev，剂量为3×10¹⁴ions/cm²-6×10¹⁴ions/cm²，获得诱变后的蛹虫草孢子。

3)培养诱变后的蛹虫草孢子，通过平板初筛筛选得到菌丝生长速度快、菌丝密度大、色素颜色深、菌落较规则等特征的蛹虫草菌株；

4)将步骤3)筛选到的蛹虫草菌株进行液体发酵培养，然后采用高效液相色谱法测定发酵液中虫草素含量，筛选得到正突变菌株；

5)将筛选得到的正突变菌株采用优化后的培养工艺液体培养，然后恒温静置培养，得到虫草素产量高的蛹虫草发酵液。