[发明专利]一种心肌组织工程产品及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种以大网膜脱细胞基质为支架材料的心肌组织工程产品及其构建方法。

背景技术

心肌组织工程是融合细胞生物学、生物材料学和工程学的原理和技术，将具有形成心肌组织能力的种子细胞与具有良好生物相容性、可降解性与一定的生物力学特性的生物支架材料复合，体外构建出能够进行心肌移植、修复心肌损伤的工程化心肌组织，其主要研究内容涉及种子细胞、支架材料以及工程化心肌组织构建等三个方面。其中，生物支架材料的选择是开展工程化心肌组织构建的关键。

组织工程支架材料需要具备良好的生物相容性，没有免疫原性，合适的降解时间，且应该具有一定的结构和力学特性支持细胞的生长和分化。心肌组织工程对支架材料的要求又有其特殊性：首先，心脏是全身灌注率和耗氧率最高的器官之一，与其他组织相比，心肌细胞对缺血异常敏感，因此支架材料应具有良好的生物通透性，有利于营养物质与代谢产物的运输。其次，心肌细胞的活动要求支架材料有足够的弹性、可拉伸性以及机械稳定性。第三，体内移植后容易血管化，从而便于与宿主整合。

目前，心肌组织工程常用的支架材料包括人工合成支架材料以及天然生物材料，这些材料至今都无法完全满足以上这些标准。因此，研究人员一直致力于对现有的支架材料进行优化或研发新型的生物支架材料以更好的满足心肌组织工程对生物支架材料的要求。

脱细胞技术的出现为心肌组织工程支架材料的选择指出了新的方向。利用脱细胞技术去除组织中各种细胞成分以及遗传物质而获得的天然生物支架材料及脱细胞基质材料，保留了细胞外基质的三维结构和天然成分，有利于细胞粘附、增殖、分化及其生物学功能的发挥。目前，研究人员已经获得了各种不同组织来源的脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、角膜、肺、肝、肾等。尽管如此，上述脱细胞基质材料均不能满足心肌组织工程支架材料的特殊需求。而心脏脱细胞基质本身也存在供体来源短缺的问题。因此，亟需开发新的基于脱细胞技术的心肌组织工程支架材料。

大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜组织，从胃与肠之间向前膨出，在肠的前方下垂形成皱襞，呈围裙状遮被空、回肠。大网膜来源广泛，高度血管化，富含各类生长因子，且具有很好的力学性能，目前已广泛用于各类移植物的体内移植平台。然而，目前大网膜脱细胞基质相关研究刚刚起步，尚未见以大网膜脱细胞基质为支架材料，构建工程化心肌组织的相关报道。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了心肌组织工程产品的制备方法，其包括：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体。

根据本发明的另一方面，提供了心肌组织工程产品的制备方法，其按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成的脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min；将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于由十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶组成的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L的DNA酶、0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶，浸泡时间为12-24h，震荡频率为100-200r/min；将经脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体

将1×10⁶-1×10⁷/mL的心肌细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2h，然后添加DMEM培养液8-15mL，继续培养至第7-21天，每12h更换一次培养液，培养结束即可获得心肌组织工程产品。

根据本发明的再一方面，提供了根据上述方法获得的心肌组织工程产品，其包含心肌细胞和大网膜脱细胞基质支架材料。

与其他方式构建的心肌组织工程产品相比，本发明中构建的心肌组织工程产品以大网膜脱细胞基质为支架材料，由于大网膜脱细胞基质具有良好的三维网状空间结构，且富含生长因子，因此其有利于心肌细胞的生长以及营养物质与代谢产物的运输，对未来应用该心肌组织工程产品进行心肌损伤修复以及以其为模型进行心肌治疗性药物筛选等具有重要意义。