[发明专利]一株有效降解己烯雌酚的枯草芽孢杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体涉及一株可降解己烯雌酚的枯草芽孢杆菌。

背景技术

己烯雌酚（diethylstilbestrol, DES）是一种人工合成的非甾体雌激素类药物，曾被用作提高动物生产性能的药物。DES作为一种内分泌干扰物，能够引起肝脏损伤，发育早熟，基因突变以及激素失调，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。由于其对激素系统有影响，对机体具有慢性毒性，美国FDA和中华人民共和国农业部均规定禁止其使用于动物性食品生产。

目前己烯雌酚的残留问题仍然很严重，加泰罗尼亚地区的污水处理厂排出的废水中DES的含量为34 ng/L，高舒榭等对南阳市市售鸡肉随机抽取检测的40份样品中均检出了DES，残留量最高的达10 mg/kg。动物养殖户违规使用，化学排放，污水处理厂和垃圾填埋场等都可能导致DES残留于动物性食品、水体和土壤环境中。近年来，降解或消除DES的方法已受到广泛关注。

微生物降解法被认为是消除有害化合物污染的有效方法，筛选高效降解DES的功能微生物是实现减少或消除环境中DES的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一株可有效降解己烯雌酚的菌株—枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JF。

本发明所提供的降解菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JF，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 7950，保藏日期为2013年7月22日。

所述枯草芽孢杆菌降解DES的步骤为：1）菌株JF活化：挑取枯草芽孢杆菌JF于LB培养基上划线，30 ℃培养24 h。

2）菌株JF降解DES：用无菌生理盐水将LB培养基上的菌苔洗脱并混匀制备菌悬液。移取1 mL菌悬液接种于装有29 mL LB培养基（含0.2%吐温80）的250 mL三角瓶中，加入DES至一定浓度，以1 mL生理盐水代替菌悬液为空白对照。30 ℃、180 r/min振荡培养，定时取样，提取DES，采用HPLC测定DES降解率。

所述微生物降解DES体系中DES的提取方法为：准确移取1 mL均匀培养液于10 mL刻度试管中，用甲醇定容至10 mL，于超声波清洗器（AS10200A）中超声提取20 min；混匀，取1.5 mL 样品12 000 r/min离心15 min，将上清液用0.45 μm 有机相滤膜过滤，弃去初滤液约0.5 mL，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，分析仪器为LC-10A2010C HT型高效液相色谱仪。

所述微生物降解体系中DES检测方法为：LC-10A2010C HT型液相色谱系统，Sepax GP-C18柱（150 mm×4.60 mm，5.0 μm）为色谱柱，甲醇:水（7:3;v/v）为流动相，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，用紫外检测器在242 nm处检测。

本发明所用培养基为LB培养基：酵母膏 5 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 10 g、水1000 mL，调节pH至7.0，121 ℃灭菌15 min。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：枯草芽孢杆菌属于“公认安全”的菌种，该枯草芽孢杆菌降解DES，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境中的DES残留提供了良好的菌源和思路。

附图说明

图1为降解菌株JF处理前后DES的HPLC谱图，图中0 h为含接种JF的25 mg/L DES的LB培养基中立刻取样处理得到的HPLC检测的色谱图，5 d为培养5 d后取样处理得到的HPLC检测的色谱图。

图2为降解菌株JF作用于25 mg/L DES的降解曲线。

图3为降解菌株JF对不同浓度DES的降解能力。

具体实施方式

实例1：不同培养时间对菌株JF降解DES的情况。

种子液制备：挑取JF菌种于LB平板上划线，于30 ℃恒温培养箱中培养24 h后挑取单菌落在LB斜面培养基上划线，30 ℃恒温培养箱中培养24 h；用无菌生理盐水将斜面培养基上的JF菌苔洗脱并混匀制成种子液（菌浓度约为10⁸ CFU/mL）。