[发明专利]一种血液及尿液中硫化氢的测定方法

说明书

技术领域

    本发明属于体内药物检测技术领域，具体涉及一种血液及尿液中硫化氢的检测方法，特别是一种分散固相微萃取结合高效液相色谱测定血液及尿液中的硫化氢的方法。

背景技术

在心血管系统中，硫化氢(H₂S)能开放ATP敏感的钾离子通道，使血管平滑肌舒张，降低血压；体内H₂S生成减少与自发性高血压的形成有密切关系；外源性给予H₂S能有效保护心肌的缺血性损伤。由于能在体内产生，并具有多种生理功能，H₂S成为继NO和CO后的第三个气体信号分子。越来越多的证据表明内源性H₂S与多种疾病有着密切的关系，在临床多种疾病中，内源性H₂S的生成和代谢发生了改变，并进一步影响了疾病的发展过程，以H₂S为靶点的治疗具有潜在的临床应用前景；一种可靠、准确的血液、尿液中内源性H₂S的测定方法对监测体内H₂S含量及相关疾病的预测及诊断有重要意义。

H₂S检测方法主要包括亚甲基兰分光光度法、硫离子选择电极法、荧光衍生法、气相色谱法、荧光探针及免疫分析法等。目前现有H₂S检测技术主要集中在大气、水等环境样品中，其检测灵敏度在1mg/kg，而体内内源性硫化氢（H₂S）含量在μmol级。研究小组之前已利用分散液液微萃取结合光度法、共沉淀结合高效液相色谱法对血液及尿液H₂S检测进行了研究，取得了不错的效果，申请了发明专利（201410382081）及（201410062197）。进一步研究发现，血液及尿液由于基体复杂，存在颜色、蛋白、脂肪的影响，共沉淀及液液微萃取存在基体分离不完全的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种稳定性好、干扰小、准确、灵敏、快速测定血液及尿液中硫化氢含量的方法。

本发明利用硅酸纳改性的磁性纳米材料（Fe₃O₄@SiO₂）吸附硫化氢衍生物亚甲基蓝，对目标物进行快速富集，在磁场作用下能够快速将基体与磁性材料分离。由于磁性吸附剂与目标物之间的磁性吸附具有特异性，因而，避免了溶液中的悬浊颗粒对于整个吸附过程的影响，降低了基质干扰同时提高了检测灵敏度。本发明利用磁性材料结合高效液相色谱(HPLC)法，一是利用磁性材料能高效分离血液、尿液中的干扰物质；二是对硫离子衍生物亚甲基兰能快速吸附；三是洗脱剂用量小，洗脱快速，检测限可0.005μg/mL；四是纳米磁性材料可以重复用到3次以上。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

以制备的硅酸纳改性的磁性纳米材料（Fe₃O₄@SiO₂）为固相萃取剂，按每5mL尿液或处理过的血液中加入质量百分比浓度为0.2%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液100～200μL，再加入质量百分比浓度为20%三氯化铁溶液50～100μL，混合均匀，静置5～10min；加入5mol/L NaOH溶液将样品pH调至中性，3000r/min离心2～5min，吸取上清液；向上清液中加入1～3mg固相萃取剂，涡旋1～2min使固相萃取剂均匀分散在水中，然后静置5～10min后，用外磁场收集带有目标物的固相萃取剂，去掉上清液，用洗脱剂洗脱固相萃取剂，收集洗脱液，采用设置的高效液相色谱条件进行含量测定。

所述硅酸钠改性的磁性纳米材料（Fe₃O₄@SiO₂）的制备包括以下步骤：

①Fe₃O₄磁性纳米材料的制备：按照三价铁盐与二价铁盐摩尔比为2.0～1.6:1的比例将三价铁盐溶液与二价铁盐溶液溶解于5～10倍的三价铁盐与二价铁盐溶液体积的去离子水中，在氮气保护下，滴加氨水使溶液体系pH为9～12，在60～80℃、搅拌速度400～800 rpm下，水浴加热，恒温搅拌反应1～3h后，用去离子水洗涤至中性，40～80℃真空干燥6～12h，制得四氧化三铁磁性纳米材料；