[发明专利]一种爪哇根结线虫效应基因Mj‑ttl，编码蛋白及其应用

权利要求书

1.一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl，其特征在于，所述效应基因Mj-ttl的DNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl，其特征在于，所述效应基因Mj-ttl的cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1或2所述效应基因Mj-ttl编码的蛋白MJ-TTL，其特征在于，所述蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种重组载体，其特征在于，由基因Mj-ttl插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因Mj-ttl的序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于，所述植物表达载体为pTRV2或pCambia1300。

6.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4所述重组载体。

7.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl或权利要求3所述蛋白MJ-TTL在提高植物抗根结线虫能力中的应用。

8.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl在构建抗根结线虫植物中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：

S1.重组表达载体pTRV2-ttl构建：

S11.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫RNA，将RNA反转录为cDNA；

S12.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶Sac I和Xba I进行酶切，并纯化回收；

S13.同时使用限制性内切酶Sac I和Xba I酶切载体pTRV2，并纯化回收；

S14.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl；重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体Sac I和Xba I酶切位点之间插入了基因Mj-ttl的双链DNA片段；

S2.将载体pTRV1转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A；将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B；以pTRV2空载体作对照；

S3.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；将重组农杆菌A、B使用0.01M KH₂PO₄重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物；

引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO：19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ ID NO：20所示；

引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO：21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO：22所示。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，S12所述PCR扩增的程序为95℃ 2min；95℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 1min， 30个循环。

11.根据权利要求9所述应用，其特征在于，S14所述DNA片段的序列为基因Mj-ttl的cDNA序列的79～428bp，如SEQ ID NO：4所示。