[发明专利]用于原位检测核酸的超灵敏方法

权利要求书

1.检测至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：

(a)提供包含或怀疑包含所述目标核酸的样品；

(b)提供能够杂交至所述目标核酸的至少一组两个或更多个捕获探针；

(c)提供：

(i)能够杂交至标记探针的扩增子；

(ii)能够杂交至所述扩增子并且能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的预扩增子，其中所述预扩增子:扩增子之比为1:1-16之间、1:2-10之间或1:2-5之间；

(iii)标记探针，其中所述标记探针结合至辣根过氧化物酶(HRP)分子；以及

(iv)多个酪胺-荧光团分子，或酪胺-生物素或酪胺-半抗原分子以及能够检测所述酪胺-生物素或酪胺-半抗原分子的检测标记物，其中所述酪胺能够与所述HRP分子反应；

(d)将所述两个或更多个捕获探针的组杂交至所述目标核酸；

(e)将所述预扩增子、扩增子和标记探针捕获至所述两个或更多个捕获探针的组，从而将所述标记探针捕获至所述目标核酸；以及

(f)检测所述荧光团的存在、不存在或量或者与所述被捕获的标记探针有关的检测标记物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物或者抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶(AP)和显色底物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述显色底物选自：二氨基联苯胺(DAB)和固红。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标核酸选自：DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA和siRNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括将所述目标核酸捕获到固体载体上的步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含所述目标核酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含两种或更多种不同的目标核酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含两种或更多种不同的细胞，所述细胞中的每一种包含或怀疑包含不同的目标核酸。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，利用双色显色原位杂交(CISH)或双色荧光原位杂交(FISH)来检测两种不同的目标核酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，利用酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB来实施所述双色CISH以检测所述第一目标核酸，以及利用结合至碱性磷酸酶(AP)和固红的抗-DNP抗体以检测所述第二目标核酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述半抗原选自二硝基苯基(DNP)、地高辛、三硝基苯基(TNP)或荧光团。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，提供多个酪胺-荧光团分子。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，提供多个酪胺-生物素分子和能够检测所述酪胺-生物素分子的检测标记物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述检测标记物包含显色底物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述显色底物选自DAB和固红。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和DAB。

20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述检测标记物包含抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和固红。