[发明专利]一种改良的种子粗酶液提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良的种子粗酶液提取方法，特别涉及棉花种子发育过程油脂和蛋白质形成过程中粗酶液的提取方法。

背景技术

棉花是我国重要的纺织工业原料，同时，棉花种子作为重要的油脂和蛋白质的来源在生物柴油、新型材料、反刍动物饲料中具有广泛的应用前景。生物柴油的加工是以油脂经过酯化、裂解、生物酶解等方法，以10％-20％的比例添加到化石柴油中，油脂含量和脂肪酸品质决定了生物柴油加工的成本。脱脂和脱毒加工后的棉籽蛋白质含量可达40％，蛋白质含量的高低决定了反刍动物饲料价值的高低。

研究蛋白质和油脂的合成过程中关键酶的活力是通过农艺学措施和生物技术手段提高油脂和蛋白质品质的根本途径。然而，棉花种子子叶中含有大量的腺体，腺体所分泌的大量酚类物质严重影响酶活力测定的准确性。现有的粗酶液提取方法在进行酶活力测定时准确性、可重复性不高，甚至无法检测出结果，其次，检测过程中反应体系的体积比较大、药品成本高导致检测成本高昂。因此，粗酶液的提取过程需要根据棉花种子的生物学特性加以改进，以提高测定的准确性和可重复性，并且酶活力测定过程的反应体系体积可显著的减少以降低检测成本。

发明内容

本发明的目的在于针对背景技术提出的技术问题，提供一种改良的种子粗酶液提取方法，本方案根据棉花种子的生物学特性进行了一系列的改进。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种改良的种子粗酶液的提取方法，包括以下步骤：取发育过程中的种子和预冷的改良提取液充分研磨得到匀浆，向匀浆中添加石油醚或乙醚混匀静置后离心分离得到种子粗酶液，所述的改良提取液为向原提取液中添加甘油和聚乙烯吡咯烷酮得到的。

作为一种优选技术方案：

所述的甘油在改良提取液中的体积百分比浓度为4％～10％。

所述的聚乙烯吡咯烷酮在改良提取液中的质量浓度为1％～5％(即1L改良提取液中添加1～5g聚乙烯吡咯烷酮)。

所述石油醚或乙醚的添加量为所述匀浆体积的20％～50％。

一般情况下，种子和改良提取液的质量体积比为0.05～0.2g/ml。

制备不同种类的粗酶液，采用的原提取液配方不同：

制备的粗酶液为谷氨酸合成酶粗酶液时，所述的改良提取液为向原提取液50mM pH＝7.2的磷酸缓冲液中添加甘油和聚乙烯吡咯烷酮得到的。优选的，提取所述谷氨酸合成酶粗酶液所使用改良提取液的配方为：50mM pH＝7.2的磷酸缓冲液，4％～10％v/v甘油，1％～5％w/v聚乙烯吡咯烷酮(即1L改良提取液中添加1～5g聚乙烯吡咯烷酮)。进一步优选的配方为：50mM pH＝7.2的磷酸缓冲液，5％v/v甘油，2％～3％w/v聚乙烯吡咯烷酮(即1L改良提取液中添加2～3g聚乙烯吡咯烷酮)。

制备的粗酶液为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶粗酶液时，所述的改良提取液为向原提取液中添加甘油和聚乙烯吡咯烷酮得到的，所述的原提取液的配方为：300mM蔗糖,50mM pH＝7.0Hepes-Tris,8mM EDTA，2mM PMSF，4mM DTT。优选的，提取所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶粗酶液所使用改良提取液配方为：300mM蔗糖,50mM pH＝7.0Hepes-Tris,8mM EDTA，2mM PMSF，4mM DTT，4％～10％v/v的甘油，1％～5％w/v的聚乙烯吡咯烷酮(即1L改良提取液中添加1～5g聚乙烯吡咯烷酮)。进一步优选的配方为：300mM蔗糖,50mM pH＝7.0Hepes-Tris,8mM EDTA，2mM PMSF，4mM DTT，5％v/v的甘油，2％～3％w/v的聚乙烯吡咯烷酮(即1L改良提取液中添加2～3g聚乙烯吡咯烷酮)。

上述的方法中，优选的所述的种子为棉花种子。

本发明的详细的最优选技术方案为：

(1)配制提取液：

谷氨酸合成酶改良提取液成分为：50mM pH＝7.2的磷酸缓冲液，5％v/v的甘油，2％w/v的聚乙烯吡咯烷酮。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶改良提取液成分为：300mM蔗糖,50mM pH＝7.0Hepes-Tris,8mM EDTA，2mM PMSF，4mM DTT，5％v/v的甘油,2％w/v的聚乙烯吡咯烷酮。

上述提取液于4℃保存；其中甘油为体积百分比浓度，聚乙烯吡咯烷酮为质量浓度。

(2)取样研磨：