[发明专利]金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法

说明书

本发明公开了一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽及其制备方法，该抗氧化铁螯合肽的氨基酸序列为Tyr‑Ile‑Val‑Tyr‑Trp，ESI‑MS检测分子量为742.84 Da，制备时以金枪鱼暗色肉作为原料，经过脱脂、中性蛋白酶酶解、超滤、凝胶过滤层析和反相高效液相纯化，得抗氧化铁螯合肽Tyr‑Ile‑Val‑Tyr‑Trp。

技术领域

本发明涉及一种功能性肽的制备方法，尤其涉及金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法。

背景技术

金枪鱼为大洋性鱼类，广泛分布于太平洋、印度洋和大西洋的中低纬度的近海、外海和大洋中，属高度洄游鱼类种群，是世界远洋渔业发展的重点目标鱼种。金枪鱼肉味鲜美，营养丰富，具有红肌型肉质，加之常年生活于无污染的深海区，被视为绿色、安全、无污染食品，因而被国际营养学会推荐为世界三大营养鱼类之一。据联合国粮农组织统计，目前世界大洋性渔业总产量为850万吨，其中金枪鱼产量超过600万吨，占公海渔业总产量70%以上。在金枪鱼加工过程中产生约占总重量50%～70%的下脚料，其中暗色肉约占原料的11%，是制备活性多肽的优质原料，但并未得到有效利用。

申请人研究发现，以金枪鱼暗色肉为原料，利用酶解技术制备抗氧化铁螯合肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗氧化铁螯合肽更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，该工艺科学合理、易操作，所得到的肽具有很好的抗氧化和铁螯合活性。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金枪鱼暗色肉的预处理：取金枪鱼暗色肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95～100℃后保温10～15min，然后降至室温，按照料液比1g:3～5mL加入异丙醇，室温下脱脂20～24 h，然后于4℃、9 000 rpm离心25～30min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；

2）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1g:20～25mL加入磷酸盐缓冲液（pH 6.5～7.5），得混合液；将混合液温度升至55～65 ℃预热5～10 min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.0%加入蛋白酶，酶解温度为55～65℃，酶解3～5 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为酶解产物；

3）金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到抗氧化铁螯合肽。

作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）。

作为优选，所述步骤2）中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥1.0×10⁵ U/g。

作为改进，所述步骤3）中的凝胶过滤层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基（DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基）清除活性最高组分为凝胶层析酶解物。