[发明专利]金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法

权利要求书

1.一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）金枪鱼暗色肉的预处理：取金枪鱼暗色肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95～100℃后保温10～15min，然后降至室温，按照料液比1g:3～5mL加入异丙醇，室温下脱脂20～24h，然后于4℃、9000rpm离心25～30min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；2）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1g:20～25mL加入pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液，得混合液；将混合液温度升至55～65℃搅拌预热5～10min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.0%加入蛋白酶，酶解温度为55～65℃，酶解时间3～5h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min，10000g离心20～25min，取上清液，即为酶解产物；3）金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱纯化，得到抗氧化铁螯合肽；

所述步骤3）的凝胶过滤层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25mg/mL的溶液，经过规格为2.6×80cm的葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用pH6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物；所述的自由基包括DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基；RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，得1个高活性抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp，ESI-MS检测分子量为742.84Da。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼，所述鲣鱼拉丁名为Katsuwonus pelamis。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥1.0×10⁵U/g。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱条件为：进样量15～20μL；色谱柱为Zorbax SB-C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为25～30℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脱：0-6min为水，6min以后乙腈浓度每分钟升高0.5%；洗脱速度0.8～1.0 mL/min；紫外检测波长220nm。