[发明专利]一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用。

技术背景

随着能源危机的不断高涨以及环境问题日益突出，利用再生资源制备生物燃料领域越发受人瞩目，其重要性也不断凸显。在过去几十年中，生物乙醇的生产一直受人关注。其中，利用运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）制备生物乙醇的研究已进行多年。运动发酵单胞菌作为唯一一种通过Entner-Doudoroff(ED)代谢途径发酵葡萄糖的微生物，具有较高的乙醇发酵力和乙醇耐受性等优势，在生物乙醇生产中具有重要地位。

然而，在纤维素等生物质乙醇发酵过程中，许多环境压力因素抑制着菌体的生长及其乙醇发酵的能力。高乙醇浓度、渗透压以及有氧胁迫等是抑制运动发酵单胞菌的生长和乙醇发酵的主要因素。如何获得高耐受性菌株，是研究者多年来的愿望。

然而，在现有技术中，可耐乙醇的运动发酵单胞菌少之又少，且耐受能力普遍较低。其原因在于，一般的诱变育种方法所需时间长、效率低且随机性巨大。随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造细菌并获得耐乙醇的运动发酵单胞菌可能成为解决这一问题的方法。然而，在如何对运动发酵单胞菌进行基因改造使之耐受乙醇方面上，目前的研究还很少，且尚未获得确切认识。

因此，亟待找到一种可以获得耐乙醇运动发酵单胞菌的基因工程改造方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一株耐乙醇运动发酵单胞菌，该耐乙醇运动发酵单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N；所述耐乙醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；所述耐乙醇运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas mobilis ZM4-mropD，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所 邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.10617，保藏时间为2015年3月12日。

一般而言，Q57残基负责调控DNA连接和启动子连接，以获得正确的启动，因此，突变Q57L有可能影响了DNA和启动子对RNA聚合酶的连接。突变I448N的作用，有可能是以一种未知而精妙的方式影响着转录。虽然该菌株耐乙醇的机理还有待研究，但该菌株的耐乙醇性能是十分优良的。如本发明的一个实施例所示，本发明的菌株可以耐受初始浓度至少为9%的乙醇，在乙醇初始浓度为10%时仍可以较为良好的生长。在含有乙醇初始浓度为9%的RM培养基中，本发明菌株ZM4-mrpoD在培养48h后，菌体浓度便达到了OD₆₀₀=1.5，而对照菌株ZM4-rpoD（RpoD未受突变）的菌体浓度仅为OD₆₀₀=0.8。

需要指出的是，本发明得到的菌株含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N，任何在本发明的基础上，再对其它无关的位置进行突变而得的菌株，均实质上与本发明相同，仍属本发明的保护范围。

本发明的第二个目的在于提供耐乙醇运动发酵单胞菌的制备方法，该方法包括如下步骤：

1）突变rpoD基因的制备：利用GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis Kit对rpoD的PCR产物进行易错聚合酶链式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q57L、G426C和I448N的突变rpoD基因；

2）重组质粒pBmrpoD的构建：将步骤1）所得物进行纯化后，用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理，再连接到与质粒pBBR1MCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒pBmrpoD，所述pBBR1MCS-tet含有丙酮酸脱羧化酶的启动子和终止子；

3）将重组质粒pBmrpoD转化入运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4中，并在培养基中进行培养；

4）将步骤3）的培养物接种到含有乙醇的培养基中，乙醇初始浓度为7-9%，经三轮筛选后，将细菌置于含有9%乙醇和5 μg/ml四环素的固体培养基上培养，随机挑选单克隆，提取质粒后，进行DNA测序。

所述纯化是利用E.Z.N.A®Gel Extraction Kit，并严格按照产品说明书操作说明进行的。

步骤3）和步骤4）中，所述培养基为RM培养基。

步骤3中，所述转化为电转化。