[发明专利]一种水蛭素提取分离的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗凝血化合物的过滤提取方法，具体涉及一种水蛭素的提取分离工艺。

背景技术

水蛭素是从吸血水蛭(俗称蚂蟥)中提取的一种抗凝血物质。水蛭，首载于我国《神农本草经》，后在《本草纲目》和《中国动物药》等专著中均有收载。1884年，Haycraft发现水蛭提取物有抗凝血作用，1955年，MarkwMdt指出这种抗凝血物质为蛋白质，定名为水蛭素，1986年后基因重组水蛭素问世，为水蛭素的深入研究和临床应用开辟了广阔前景。根据文献记载，天然水蛭素是由65个氨基酸组成的低分子多肽，其作用有以下几个方面：

1、具有抗凝血作用：不同来源和结构的水蛭素，其抗凝血机制不尽相同。因此天然水蛭素可从多个环节影响血液凝固和血栓形成。

2、抗凝血酶作用：水蛭素的抗凝血酶作用见于欧洲医用水蛭(hiNmedic5nalis)L1j、亚洲水牛蛭(菲牛蛭)和印度水蛭等。由这些水蛭中提取的水蛭素含6个分布相似的半胱氨酸残基，具有相似的三维结构：其N端由二硫键形成紧密结构，且与凝血酶活性位点结合；其C端富含酸性氨基酸残基，则与凝血酶的纤维蛋白原结合位点结合；中间区的氨基酸残基协调作用。这种结构可以达到水蛭素与凝血酶呈1∶1的比例形成稳定的复合物，从而对凝血酶有高度特异的抑制作用，起到抑制凝血酶的抗凝血作用。

3、抗血小板作用：1992年，Como等从墨西哥水蛭中提取出一种称为菲牛蛭抗血小板蛋白质，具有特异性抑制胶原诱导血小板聚集的作用，而对其他诱导剂(如血、凝血酶等)诱导血小板聚集无抑制作用。1994年，Kmel等从北美水蛭中提取一种含39个氨基酸残基的多肽，其三维构象与水蛭素很相似，C端的RGD序列与血小板膜GPIIb/IIIa相识别，从而抑制了纤维蛋白原介导的血小板聚集作用。

4、降解纤维蛋白(原)作用：1984年，Malin-conlco等从亚马逊巨型水蛭中提取一种称为hementin的物质。这种物质可以降解纤维蛋白(原)的特定肋链，具有抗凝血酶活性并能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。

中国专利ZL2010105266817公开的《一种从天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法》，该方法是将氯化钠、一水乙酰半胱氨酸盐、赖氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种或多种物质进行组合，溶解于去离子水中配制成刺激液，刺激液中各物质的重量百分浓度为0.01～5％，其中酶浓度在100U～300U/ml。将活体水蛭称重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液体积为1：1～5倍加入所述刺激液，刺激3小时使水蛭分泌分泌液，分泌液经过16000～20000r/min离心分离得水蛭素粗品，经0.2微米不锈钢膜微滤，再进行反渗透纳滤浓缩，然后按固体比液体的重量体积比为1：6～10加入药用淀粉调配，经喷雾干燥，得水蛭素成品。这种提取方法复杂，操作难度高，杂志去除不够彻底，提取效率低，而且有机溶剂使用多，环境污染大。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种易于操作、成本低、效率高、纯度好的水蛭素的提取分离工艺。

实现本发明目的的技术方案是一种水蛭素提取分离的工艺，包括以下步骤：

步骤一：对水蛭提取液进行过滤：将水蛭打碎匀浆之后的提取液经过陶瓷滤膜过滤，收集过滤液，再用蒸馏水进行陶瓷滤膜清洗；合并陶瓷滤膜过滤液和清洗液，再经有机滤膜过滤，收集过滤液，再用蒸馏水进行有机滤膜清洗；

步骤二：洗脱：将步骤一得到的有机滤膜过滤液和清洗液通过凝胶色谱柱洗脱，再通过高压液相层析仪检测洗脱液；

步骤三：纯化：将水蛭素色谱纯度达到80％以上的流分进行收集，将收集到的洗脱液再经纳滤膜浓缩，得到纳滤浓缩液后，将浓缩液经过反相c18半制备柱进行纯化，收集目标峰值；

步骤四：对步骤三得到的液体进行冷冻干燥，得到冻干水蛭素纯品。

所述步骤一中，用蒸馏水进行陶瓷滤膜清洗的体积量为陶瓷滤膜过滤液的25～30％；用蒸馏水进行有机滤膜清洗的体积量为有机滤膜过滤液的10～15％。

所述步骤一的工作温度为25℃～35℃，压力为0.05Mpa～0.3Mpa。

所述步骤一中的陶瓷滤膜规格为30KDa～300KDa截留分子量；且后一次使用的陶瓷滤膜的截留分子量小于前一次陶瓷滤膜的截留分子量。

所述步骤一中的有机滤膜规格为0.8～1KDa截留分子量。

所述步骤一中，第一次和第二次蒸馏水清洗前，增用当次清洗用蒸馏水5％体积量的蒸馏水进行容器和膜的润洗。