[发明专利]靶向定点整合CHO细胞系的改造及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及细胞基因工程领域，具体涉及一种定点整合外源基因的FRT-sCHO细胞系及其在生物制药领域的用途。

背景技术

提高哺乳动物细胞外源基因表达水平和稳定性，一直是生物制药领域或基因工程领域不断发展的追求。尽管大多数商业化表达体系尤其表达载体都有针对性的优化设计，如选择强启动子，带有加压筛选系统等，但获得高表达外源蛋白的细胞仍然需要耗费巨大的精力和成本。通过常规技术引入外源基因的整合具有随机性，插入位置不支持强转录发生，并导致蛋白表达水平较低，即使短时的高水平表达，也不能维持其稳定性，并随传代次数增加表达水平逐渐下降。因此，外源基因插入染色体的“位置效应”以及整合位点是否在高转录活跃区等被提出是影响蛋白表达水平及其稳定性的重要因素。只有对目的基因实施定向整合如整合至基因组的特定位置，才可能实现外源基因的稳定整合和蛋白高水平表达。

基因定向整合有多种方法，如同源重组技术尤其位点特异性重组技术，其依靠位点特异性重组酶，在基因组和外源DNA上的重组酶特异识别位点间实现基因置换、基因敲出和敲入等遗传工程操作。基因定向整合由于能有效克服随机整合、靶向性低以及易受位置效应影响等缺点，位点特异性重组技术在基因工程中的应用已为外源基因定点整合奠定了良好基础。从八十年代发展至今，位点特异性重组技术已多达十余种，其中最主要的技术为FLP/FRT和Cre/loxP系统。FLP/FRT技术在哺乳动物细胞中的应用开始于九十年代初期。O’Gorman等应用FLP重组酶技术实现了将外源基因整合进入预先确定的哺乳动物细胞染色体位点(Science.1991 Mar 15；251:1351-5.Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells)；Wiberg FC等应用FLP/FRT技术将编码抗体的基因整合进入CHO细胞基因组，首先在CHO细胞基因组特定位点插入1个FRT位点，建立含有单个FLP重组酶识别位点的宿主，然后将同样含有单个FRT位点的抗体表达载体以及FLP重组酶表达载体共转染宿主细胞，编码抗体的基因在FLP重组酶的作用下，定点整合在细胞基因组的相同位点，有效克服了位置效应对抗体表达水平的影响(Biotechnol Bioeng.2006,94:396-405.Production of target-specific recombinant human polyclonal antibodies in mammalian cells.)。目前，通过FLP/FRT技术已推出系列商业化细胞系，包括Flp-In^TM-293、Flp-In^TM-CV-1、Flp-In^TM-CHO、Flp-In^TM-BHK和Flp-In^TM-3T3等细胞系，这些细胞系均可借助重组酶体系完成细胞基因组与外源DNA的位点特异性重组。然而，所述细胞系均为贴瓶生长，作为产业化用途尤其在表达治疗性蛋白或治疗性单克隆抗体方面的运用具有很大的局限性。中国专利(申请号：200310115022.4)公开了一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统,该系统能够实现外源基因在CHO/dhfr-细胞基因组中定点整合和有效表达。该系统通过随机筛选在基因组中转录活跃区整合FRT位点的CHO/dhfr-细胞系而获得，但基因组转录活跃区位点并没有确定。PCT专利(2012)公开了一种染色体着陆垫(chromosomal landing pad)及其相关用途，尤其公开了强转录活性位点位于宿主细胞的Ank2、Cpsf4、C-Mos、Nephrocystin-1/Mal基因之内或附近的染色体着陆垫，这些染色体“着陆垫”均借助FLP/FRT技术实现，并成功用于外源基因的定点整合。