[发明专利]提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及通过构建双基因串联过表达载体，并在吸水链霉菌子囊亚种菌体内表达，构建高效子囊霉素基因工程菌及其构建方法和工程菌株在子囊霉素发酵生产中的应用。特别是涉及提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株及构建方法。

背景技术

子囊霉素(ascomycin,FK-520)是由吸水链霉菌子囊亚种(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus)发酵产生的一种由二十三元环组成的大环内酯类抗生素。是由聚酮合酶/非核糖体合成酶共同合成的，具有抗真菌和免疫抑制活性的天然化合物。子囊霉素最早是从S.hygroscopicus var ascomyceticus发酵产物中分离出来，被认为是抗真菌的抗生素，在研究低毒性FK506的类似物时发现了子囊霉素具有免疫抑制特征。子囊霉素曾成功用于预防器官移植排异，并且在类风湿性关节炎和牛皮癣等方面的治疗也有显著功效。子囊霉素除了在治疗自身免疫疾病中有不错的疗效，还具有抗痉挛、抗疟疾、神经保护再生等活性，有巨大的药用价值和市场价值。(Okuhara M(1990)Tricyclo compounds,a process for their production and pharmaceutical composition containing the same:US,4894366；Sierra P G(2008)pharmacology and therapeutic potential as anticonvul-sants and neuroprotectants.CNS Neurosci Ther,14:36-46)目前，我国的子囊霉素的相关研究还正处于发展阶段，获得具有我国自主知识产权的高产子囊霉素的工程菌株和发酵技术迫在眉睫。

特异调控基因编码的不同类型蛋白的表达水平对次级代谢产物的产量影响不同，比如：allN基因编码的AsnC调控蛋白的同源蛋白的过量表达对次级代谢产物他克莫司的产量物明显的影响，而fkbR、fkbN编码的LysR-type转录蛋白家族和LAL转录调控家族的蛋白的过量表达可明显地提高他克莫司的产量。因此，过表达次级代谢物生物合成的特异调控基因对提高次级代谢物的产量和降低生产成本是很有必要的。本发明对子囊霉素生物合成基因簇序列进行生物信息学分析，提出fkbN为子囊霉素生物合成相关基因，其编码的蛋白属于LAL家族的ATP结合转录调控蛋白，ATP结合转录蛋白可以促进次级代谢物的合成。

存在吸水链霉菌基因组中的frr基因编码的核糖体再生因子(RRF)可以催化终止前复合物核糖体-mRNA-tRNA的解离和核糖体的再循环，RRF可以有效地促进蛋白合成的活力，终止前复合物的再循环成分可以提高蛋白合成的效率，而RRF的过量表达可以有效地增强蛋白的合成和抗生素的高产。本发明选择编码ATP结合转录蛋白的fkbN和编码RRF蛋白的frr基因为目标基因构建双基因串联的过表达载体，通过fkbN和frr基因的过量表达共同高效促进子囊霉素的生物合成，构建高效生产子囊霉素工程菌株。

目前，对于链霉菌基因工程菌株的构建方法日趋完善，而国内外对于吸水链霉菌子囊亚种基因工程菌株的研究很少，而通过过表达fkbN和frr串联基因来构建子囊霉素基因工程菌株的专利研究未见报道。

发明内容

本发明通过构建fkbN和frr双基因的过表达载体，在出发菌株体内表达，使得fkbN蛋白和RRF蛋白过量表达从而增强子囊霉素的生物合成，获得了高效产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。本发明构建过表达fkbN和frr串联基因的生产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01，对提高子囊霉素的产量具有现实意义和应用价值。

本发明的技术方案如下：

一种提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株；其特征在于基因工程菌为吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 10615。