[发明专利]一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法

权利要求书

1.一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中；

步骤二：用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面组织剪掉留婴儿面备用；

步骤三：剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成1-3mm3大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37℃培养箱中消化15h备用；

步骤四：用1000mlPBS稀释步骤三消化液后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞备用；

步骤五：弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞；

步骤六：使用添加有5%组成为：3%-6%结合蛋白；0.5%-1.5%生长因子；0.5%-1.5%（组氨酸：脯氨酸3：1）；0.03%-0.07%固醇类激素；0.1%-0.5%【（维生素B1：维生素B2：维生素B6：维生素B12 1：1：1：1）： 维生素C ：维生素D ：维生素E 1：1：1：1】；0.01%-0.03%（铁：锌：钼：钴2：2：1：1）；0.5%-1.5%粘附因子；87.4%-95.36%去离子水的血清替代物MEM-α培养基重悬细胞并接种于10cm细胞培养皿中，于37℃、体积分数为5%CO₂培养箱内进行培养，3-4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM-α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；

步骤七：待细胞扩增至3-6×10⁷个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM-α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为：以1℃/min的速率降至-5℃后，以3℃/min的速率降至-20℃，再以1℃/min的速率降至-60℃，最后以5℃/min的速率降至-120℃，结束后放入液氮中冻存。

2.根据权利要求1所述的一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于步骤六中血清替代物的组成为：3%结合蛋白；0.5%生长因子；0.5%非必须氨基酸（组氨酸：脯氨酸3：1）；0.03%固醇类激素；0.1%【（维生素B1：维生素B2：维生素B6：维生素B12 1：1：1：1）： 维生素C ：维生素D ：维生素E 1：1：1：1】；0.01%（铁：锌：钼：钴2：2：1：1）；0.5%粘附因子； 95.36%去离子水。

3.根据权利要求1所述的一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于步骤六中血清替代物的组成为： 6%结合蛋白； 1.5%生长因子； 1.5%（组氨酸：脯氨酸3：1）； 0.07%固醇类激素； 0.5%【（维生素B1：维生素B2：维生素B6：维生素B12 1：1：1：1）： 维生素C ：维生素D ：维生素E 1：1：1：1】； 0.03%（铁：锌：钼：钴2：2：1：1）； 1.5%粘附因子；87.4%去离子水。

4.根据权利要求1所述的一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于步骤六中血清替代物的组成为：5%结合蛋白；1%生长因子；1%（组氨酸：脯氨酸3：1）；0.05%固醇类激素；0.3%【（维生素B1：维生素B2：维生素B6：维生素B12 1：1：1：1）： 维生素C ：维生素D ：维生素E 1：1：1：1】；0.02%（铁：锌：钼：钴2：2：1：1）；1%粘附因子；91.63 %去离子水。