[发明专利]一种特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到利用一种SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一种与棒曲霉素高特异性和高亲和力的核酸适配体，为该核酸适配体在快速检测棒曲霉素提供基础。

背景技术

棒曲霉素(Patulin)是由青霉属、曲霉属、丝衣霉属产生的真菌代谢产物，主要在苹果及其制品中常见。棒曲霉素对热稳定，100℃加热15分钟仍然不能破坏其结构，且在酸性溶液及有机溶剂中能长期保存。棒曲霉素曾因为其抑制多种菌生长而被用作抗生素，它具有引起抽搐、肠道出血、肺部出血、肾脏损害等急性毒性，同时具有神经毒性、免疫毒性、基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前检测棒曲霉素的方法有：薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法(LC)、反相高效液相色谱(reveresed-phase HPLC)、色谱联用技术(GC/MS,LC/MS)、酶联免疫法(ELISA)等。这些方法检出限低、精密度高，但操作复杂、检测成本高。构建一种快速、简单、低成本的棒曲霉素检测方法有重要意义。

适配体是一种能以高亲和力与各靶分子特异结合的单链寡核苷酸，一般通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选得到。适配体以其从体外制备、高亲和性、高特异性、获得方便、易修饰等的优势引起了国内外科研人员的广泛研究。目前对于小分子物质的适配体筛选方法主要有亲和层析法、磁珠法、毛细管电泳法等，主要通过将靶分子活化后固定在固载物质上，从而将与靶分子结合的适配体分离出来。这种方法对靶分子结构有较高的要求，即其结构中含有易活化基团，并且活化之后对原结构产生较小的变化和影响。氧化石墨烯可以通过π-π堆叠作用吸附ssDNA，但不易吸附与靶分子结合而产生构象折叠后的ssDNA，可以用来分离与靶分子结合的适配体。

在发明中，将氧化石墨烯作为SELEX筛选的分离方法，避免改变小分子棒曲霉素的结构，避免活化将其固定于载体上，只需直接利用氧化石墨烯对ssDNA的强吸附作用，将未与靶标结合的ssDNA去除，实现对直接对天然的棒曲霉素的适配体的筛选。获得高亲和性高特异性与棒曲霉素结合的寡核苷酸适配体后，可将其化学修饰，用于发展简单便捷的检测棒曲霉素的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种对完整靶分子检测方法，特别涉及一种能特异结合棒曲霉素的适配体，为发展快速、便捷检测棒曲霉素的方法奠定基础。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以氧化石墨烯为分离方法，无需将靶分子固定在载体上，以棒曲霉素完整的结构为靶标，筛选获得与靶分子高亲和性特异结合的适配体。最终通过12轮的筛选，获得与棒曲霉素高亲和性高特异性结合的最佳寡核苷酸适配体。

本发明的优点：

与抗体和酶相比，避免了传统抗体制备中动物实验过程，而直接从体外文库中选择；适配体对体外筛选靶分子显示出高特异性和亲和力，目标范围广；获得方便，合成的重现性好，通过化学合成和修饰可以增强其稳定性；化学性质更稳定，保存时间长；避免将小分子靶标固定在载体上；避免小分子靶标的结构变化。

附图说明

图1是PAT-11寡核苷酸适配体的模拟二级结构图。

图2是PAT-11寡核苷酸适配体的饱和结合曲线图。

图3是PAT-11寡核苷酸适配体的特异性试验结果。

具体实施方式：

以下是通过SELEX技术筛选特异结合棒曲霉素的核酸适配体的进一步说明。

1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)

随机单链DNA(ssDNA)文库：5′-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT(N40)GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3′，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量为10¹⁴以上；上游引物Ⅰ：5′-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3′；下游引物Ⅱ：5′-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3′，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃贮存备用。

2、ssDNA的制备及纯化