[发明专利]基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针

说明书

技术领域

    本发明属于酶活性的高效检测技术领域，具体涉及一种基于蛋白酶类荧光共振能量转移技术（FRET） 而设计的活细胞酶活性检测探针。

背景技术

Caspase家族为天冬氨酸蛋白酶家族，主要功能是参与细胞凋亡通路，是细胞凋亡的执行者。在死亡受体介导的外源性凋亡通路中，Caspase-8 发挥着重要作用。Caspase-8酶原一个显著的特点是在其N端有2个70 aa左右的结构域，与Fas 相关死亡结构域蛋白( Fas-associated death domain protein , FADD) 的N端的死亡效应结构域(death effector domain, DED)同源，这种同源的死亡效应结构域之间可以发生相互聚合，提供了Caspase-8与FADD相互结合的一个部位。Caspase-8酶原激活后能够激活细胞中其他Caspase家族成员，如Caspase-3和Caspse-7的活化过程都有Caspase-8的参与。活化的Caspase-3又能进一步激活下游其他Caspase，从而导致细胞凋亡。在凋亡过程中，Caspase-8通过其N端的DED结构域与FADD相互结合，间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。因此，Caspase-8在外源性的死亡受体介导的凋亡通路的信号传导中以及细胞凋亡执行中都具有重要的作用，因此对于Caspase-8酶活性的检测具有重要的意义，目前对于Caspase-8活性的检测通常为western Bloting或者荧光底物检测，这类检测方法都需要对目的细胞进行裂解，而不能在活细胞水平进行酶活性检测。

荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一种通过检测两个荧光分子之间的非放射性的能量转移的技术，FRET的产生依赖于这两个荧光基团之间的物理距离。当发生FRET的两个荧光蛋白之间距离小于或等于10nm时，发生高FRET效率，当它们距离大于10 nm时，则不发生FRET 。此技术的发现使得生命科学研究中发展出一系列的相关技术。例如，FRET能够用来检测分子内或分子间的相互作用；基于蛋白酶类的FRET能够用来测定蛋白酶的活性：即在两个能够发生FRET的两个荧光蛋白之间引入特定的蛋白酶识别酶切位点，通过蛋白酶的切割使得FRET从强到弱、甚至有到无的变化，从而检测蛋白酶的活性。对于FRET效率的检测传统检测平台是基于荧光显微镜平台以及活细胞工作站平台，该检测方法在对单细胞中FRET荧光效率变化具有很好的测定效果，但对于测定细胞群体FRET水平的变化则有一定的局限性。因此，基于流式细胞仪平台的荧光共振能量转移（flow cytometric FRET，FCET）应运而生，FCET能够在整体细胞水平测定细FRET效率的变化，从而能够对FRET变化进行定量分析，这为FRET技术的运用开辟了更广阔的前景。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种新的基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针EBFP₂-C8-EGFP，便于在流式细胞仪平台检测细胞中Caspase-8活性。

本发明的第二目的是提供含有上述Caspase-8活性检测荧光探针EBFP₂-C8-EGFP的真核表达载体及其构建方法。

本发明的第三目的是提供上述Caspase-8活性检测荧光探针的用途。

本发明的第四目的是提供上述Caspase-8活性检测荧光探针检测细胞中Caspase-8活性的方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种新的基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针，为EBFP₂-C8-EGFP，其中，EBFP₂和EGFP分别表示增强型蓝色荧光蛋白以及增强型绿色荧光蛋白，C8表示Caspase-8的蛋白酶识别切割位点。

进一步的，其中Caspase-8的蛋白酶识别切割位点C8的特征序列是IETDGGIETD。

进一步的，所述的Caspase-8活性检测荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，基因全长1494 bp，编码498 个氨基酸。

二、含有权利要求1所述的Caspase-8活性检测荧光探针的真核表达载体。

上述的含有Caspase-8活性检测荧光探针的真核表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

（1）EBFP₂基因片段的获得；