[发明专利]一种登革病毒快速分型鉴别检测试剂盒

权利要求书

1.一种登革病毒快速分型鉴别检测试剂盒，包括：1)扩增反应缓冲液、引物探针反应液、扩增反应酶系、阴性质控品、阳性质控品、DEPC H₂O和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物探针反应液由登革病毒四种型特异性的正、反向引物，登革病毒四种型特异性的探针组成，其特征在于：

登革病毒I型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TTGAGATCTCTTTTTTGAAACC-3’和5’-TCTAAGATTTCTAGCCATACCC-3’，登革病毒I型特异性探针的序列是5’-TCGCTCCATTCTTCTTGAATGAGCC-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；该对引物探针可特异性地检测登革病毒I型，对登革病毒II型、III型及IV型无交叉反应；

登革病毒II型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GACGAGGACCATTAAAACTG-3’和5’-CATCTCTTCAATATCCCTGC-3’，登革病毒II型特异性探针的序列是5’-CATTCCTTCGTTTCCTAACAATCCCA-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；该对引物探针可特异性地检测登革病毒II型，对登革病毒I型、III型及IV型无交叉反应；

登革病毒III型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TGTGTGATGACACGGTCACTT-3’和5’-CACCAGCAGTCAATGTCTTCA-3’，登革病毒III型特异性探针的序列是5’-CAAATGCCCCCACATTACCGAAGTG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团Texas Red和荧光淬灭基团Eclipse；该对引物探针可特异性地检测登革病毒III型，对登革病毒I型、II型及IV型无交叉反应；

登革病毒IV型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGA-3’和5’-GCAACCTCACGTCTACCTGG-3’，登革病毒IV型特异性探针的序列是5’-CTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团Cy5和荧光淬灭基团Eclipse；该对引物探针可特异性地检测登革病毒IV型，对登革病毒I型、II型及III型无交叉反应。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所用探针5‘端可采用FAM、VIC、YELLOW、TAMRA、NED、JOE、Texas Red、Cy5、Cy3中任一种荧光基团标记；3‘端可采用TAMRA、BHQ1、BHQ2、Eclipse中任一荧光淬灭基团标记。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为0.1mmol/L。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于扩增反应缓冲液由pH值为8.0～8.8的50mmol/L Tris-HCl、3～8mmol/L MgCl₂、150～350mmol/L KCl组成。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中扩增反应酶系由Fast-Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，特征在于每人份扩增反应酶系中Fast-Taq酶的用量为3～8U，最佳用量5U；逆转录酶用量为1.5～5U，最佳用量2.5U；dNTPs为0.2～0.4mmol，最佳用量为0.4mmol。

6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为：50℃15分钟，95℃5分钟；94℃5秒，60℃20秒，45个循环。

7.根据权利要求1的试剂盒，还提供了阴性质控品和阳性质控品，其特征在于阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有登革病毒四种血清型的灭活病毒液，由四种病毒液按照浓度为1.0×10⁵copies/mL浓度等体积比混合而成。