[发明专利]工程菌及其在制备（R）‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。

背景技术

他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂药物，是目前临床上应用较广泛的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3，5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，来抑制体内胆固醇的合成，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，对以胆固醇升高为主的高血脂症和冠心病有较好的疗效。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R，5S/R)-双羟基己酸酯组成。其中，阿托伐他汀(Atorvastatin)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)是全新第三代、全合成、高纯化、高选择性的HMG-CoA还原酶抑制剂，多年来占据降血脂药物的主要市场份额。(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀的关键手性中间体，其可以通过已经建立了一个手性中心的(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯脱卤上氰基得到(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，再通过羰基还原酶的作用得到。因此，开展对((R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的合成改进，阿托伐他汀类药物的制备方法研究均具有十分重要的作用。

目前，报道的制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的方法主要有三种，两种为化学酶法，其中之一是由美国Codexis公司开发出来，先采用两步三酶[游离酶]全生物催化法合成4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，另外一种是腈水解酶不对称水解4-氰基-3-羟基丁酸铵得到4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，由法国的Diversa Corporation研发，两者都是再通过克莱森反应与醋酸叔丁酯缩合加长碳链来合成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，这过程中需要锂催化剂和无水无氧反应，反应条件较为苛刻，无法大面积推广生产；另一种是一步化学法，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，与NaCN在碱性条件下反应生成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，但底物和产物在强碱性的反应条件下通常是不稳定的。因此，与化学法相比，生物法反应更温和，费用相对低，过程更绿色化，区域和立体选择性好，更值得深入研究。

现有报道中，仅发现卤代醇脱卤酶能作用于(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，脱掉卤素把氰基连上得到(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯((文献Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，61：123-128.；专利US2013/0040364 A1))，但是催化此反应的酶的活力并不高。因此，如何能够简化制备工艺，实现(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备，且获得立体异构纯的(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，是我们有待解决的重要问题。

发明内容

本发明提供了一种工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌能够催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制得(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，提高了产物的转化率和纯度。

本发明提供了一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID NO.3所示的卤代醇脱卤酶基因。

所述的卤代醇脱卤酶基因(简称为HHDH)为全合成基因，基因来源于Agrobacterium radiobacter AD1基因组的一个突变体。

所述工程菌含有带所述卤代醇脱卤酶基因的表达载体pET-30a(+)；宿主细胞为大肠杆菌，优选地，为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。所述卤代醇脱卤酶基因在在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，使工程菌表达卤代醇脱卤酶。

本发明提供了一种所述的工程菌在以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。

具体地，本发明提供了一种(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备方法，包括：

(1)制备包含碱基序列如SEQ ID No.3所示的卤代醇脱卤酶基因的工程菌；

(2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；