[发明专利]鼓泡状接头元件和使用其构建测序文库的方法

说明书

本发明提供了一种鼓泡状接头元件和使用其构建测序文库的方法。所述接头元件是由一条核酸长链A和一条核酸短链B形成的两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种鼓泡状接头元件，使用该接头元件构建测序文库的方法，所构建的测序文库及其应用。

背景技术

上世纪九十年代，自从AB公司推出毛细管电泳测序仪，人类基因组计划启动之后，DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)测序技术便开始以难以想象的速度发生翻天覆地的变化。第二、第三代测序仪也相继推出，面向市场。

在第二代测序平台中，Complete Genomics公司(以下简称CG)的Blackbird测序平台凭借测序准确性相对其他平台更高(99.9998％)、测序通量相对其他平台更大的优势，在分子诊断等临床研究领域的应用具有巨大前景。然而，CG平台的文库构建周期太长，严重阻滞了科研、项目的开展进度，加上各种新一代测序技术迅速兴起所面临的挑战，通过技术优化来简化建库流程、缩短建库时间，以缩短CG平台的运行周期、降低生产成本是迫在眉睫的重要研发任务。

接头是一段特殊设计的DNA序列，通过连接等方法固定在DNA片段两端后，在测序时能被识别并作为测序的起始位点，供仪器读取其后的序列信息。为保证读取的序列信息易于分析，在一个DNA片段的两端(5’端和3’端)需要加上两种不同的接头序列。

CG平台经典的建库方法需要在测序文库中引入4个测序接头，建库流程繁琐，周期很长。通过改进，CG推出的双接头建库法简化了接头加入个数，建库周期可缩短约一半时间，建库流程主要包括：基因组DNA打断、第一次接头连接及PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶联反应)、双链环化并酶切、第二次接头连接及PCR、单链分离环化。其中两次加接头的方法虽然通过巧妙地序列设计，可以在保证接头定向连接的同时，最大程度地降低DNA片段间相互连接问题，但每次接头连接都需要6步酶反应才能完成。相对其他测序平台的文库构建接头连接方法还是过于繁琐，体现在酶反应步骤多、纯化步骤多，这样带来弊端就是建库效率低、成本高、样品回收率低。由于样品回收率低，建库过程需要做两次PCR扩增才能满足上机文库的总量需求，这样又进一步提高了建库成本。另外，在单链分离环节，为了富集到特异的单链DNA，需要进行两次富集筛选，也进一步降低了建库效率。因此，尽管将四接头建库法简化成了两接头建库法，建库流程长、成本高、起始量要求高的问题仍然没有得到更好地解决。

为解决Complete Genomics公司测序平台文库构建中存在的接头连接步骤过多，PCR扩增次数多、整体文库构建时间长、成本高、建库起始量要求高的问题，特提出了本发明。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鼓泡状接头元件，使用该接头元件构建测序文库的方法，所构建的测序文库及其应用。本发明通过创新的鼓泡状接头元件及其在溶液中和在磁珠上进行的连接反应技术，着重解决了CG测序平台双接头建库法中存在的接头连接步骤过多、PCR扩增次数多、整体文库构建时间长、成本高、建库起始量要求高的问题。与现有方法相比，整个建库周期和成本降低了约一半，建库起始量从3ug可降低至1ug。

第一方面，本发明提供了一种接头元件，该接头元件是由一条核酸长链A和一条核酸短链B形成的两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体，所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰，所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T；

任选地，所述杂交体中具有III类限制性内切酶识别位点；优选地，所述III类限制性内切酶的识别位点与接头元件-目标DNA连接处相距0-2bp。

关于上述接头元件，作为优选，所述杂交体按构型分为如下三个部分：