[发明专利]鼓泡状接头元件和使用其构建测序文库的方法

权利要求书

1.一种接头元件，其特征在于，由一条核酸长链A和一条核酸短链B形成的两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体，所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰，所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T；

所述杂交体中具有III类限制性内切酶识别位点；

所述杂交体按构型分为如下三个部分：

组成1：包括长链A的3’端的核酸片段A1与短链B的5’端的核酸片段B1，所述核酸片段A1与所述核酸片段B1部分互补杂交，形成互补的双链部分和位于长链A 3’末端的游离部分；

组成2：包括长链A中段的核酸片段A2与短链B中段的核酸片段B2；所述核酸片段B2与核酸片段A2不互补，从而形成鼓泡结构；

组成3：包括长链A的5’端的核酸片段A3与短链B的3’端的核酸片段B3；核酸片段A3的5’末端为磷酸化修饰，核酸片段B3的3’末端为碱基T；除了3’末端的碱基T外，核酸片段B3的所有碱基均与核酸片段A3的碱基互补配对，从而形成短链3’末端突出1个碱基T的互补双链；

其中，所述组成3中具有III类限制性内切酶的识别序列。

2.根据权利要求1所述的接头元件，其特征在于，所述III类限制性内切酶的识别位点与接头元件-目标DNA连接处相距0-2bp。

3.根据权利要求1所述的接头元件，其特征在于，所述核酸片段A1的长度为10-20nt，所述核酸片段B1的长度为8-16nt；所述核酸片段A2的长度为11-36nt，所述核酸片段B2的长度为11-21nt；所述核酸片段A3的长度为6-8nt，所述核酸片段B3的长度为7-9nt。

4.根据权利要求1所述的接头元件，其特征在于，所述核酸片段B1中具有酶作用位点。

5.根据权利要求4所述的接头元件，其特征在于，所述酶作用位点为U或dU，对应的酶为USER酶。

6.根据权利要求1所述的接头元件，其特征在于，所述核酸片段A2中含有标签序列。

7.根据权利要求1所述的接头元件，其特征在于，所述III类限制性内切酶为Acu I、BpmI、BceA I、Bbv I、BciV I、BpuE I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmF I、BtgZ I、Eci I、EcoP15I、Eco57M I、Fok I、Hga I、Hph I、Mbo II、Mnl I、SfaN I、TspDT I、TspDW I或Taq II。

8.根据权利要求1-7任一项所述的接头元件，其特征在于，所述核酸长链A的序列为：

5’-/Phos/CTGCTGACGTACTG(N)AGCACGAGACGTTCTCGACT/ddC/-3’，其中/Phos/表示磷酸化修饰，N表示标签序列，/ddC/表示双脱氧胞苷。

9.根据权利要求8所述的接头元件，其特征在于，所述标签序列长度为6nt-10nt。

10.根据权利要求8所述的接头元件，其特征在于，所述标签序列为5’-TGTCATAAAT-3’。

11.根据权利要求1-7任一项所述的接头元件，其特征在于，所述核酸短链B的序列为：

5’-GAGAACGUCTCGTGCUACGTTCTCGACTCAGCAGT-3’。

12.根据权利要求1-7任一项所述的接头元件，其特征在于，所述核酸长链A的序列为：

5’-/Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGTGCTTAGGACAT-3’，其中/Phos/表示磷酸化修饰；

所述核酸短链B的序列为：

5’-GTCCTAAGCACUGTAGTGTACGATCCGACTT-3’。