[发明专利]通过双重AAV载体有效递送大基因

权利要求书

1.一种在宿主细胞中表达感兴趣的基因的编码序列的双重构建体系统，所述编码序列由5’端部分和3’端部分组成，所述双重构建体系统包含：

a)第一质粒，其按5’-3’方向包含：

-AAV 5’反向末端重复(5’-ITR)序列；

-启动子序列；

-所述编码序列的5’端部分，所述5’端部分可操作地连接所述启动子并处于所述启动子的控制下；

-剪接供体信号的核酸序列；和

-AAV 3’反向末端重复(3’-ITR)序列；以及

b)第二质粒，其以5’-3’方向包含：

-AAV 5’反向末端重复(5’-ITR)序列；

-剪接受体信号的核酸序列；

-所述编码序列的3’端；

-聚腺苷酰化信号核酸序列；以及

-AAV3’反向末端重复(3’-ITR)序列；

所述第一质粒还包含位于其AAV 3’ITR的5’位置的重组发生区核酸序列，且所述第二质粒还包含位于其AAV 5’ITR的3’位置的重组发生区核酸序列；

所述重组发生区是F1噬菌体重组发生区，且由以下序列组成：GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(SEQ ID NO.3)。

2.如权利要求1所述的双重构建体系统，其中，在将所述第一质粒和所述第二质粒导入所述宿主细胞后，所述编码序列藉由所述剪接供体和所述剪接受体信号而得以重建。

3.如前述权利要求中任一项所述的双重构建体系统，所述ITR的核苷酸序列衍生自同一AAV血清型或不同AAV血清型。

4.如权利要求3所述的双重构建体系统，所述第一质粒的3’-ITR和所述第二质粒的5’-ITR来自同一AAV血清型。

5.如权利要求3所述的双重构建体系统，所述第一质粒的5’-ITR和3’-ITR和所述第二质粒的5’-ITR和3’-ITR分别来自不同AAV血清型。

6.如权利要求3所述的双重构建体系统，所述第一质粒的5’-ITR和所述第二质粒的3’-ITR来自不同AAV血清型。

7.如前述权利要求中任一项所述的双重构建体系统，所述编码序列在天然外显子-外显子连接处割为5’端部分和3’端部分。

8.如权利要求1所述的双重构建体系统，所述剪接供体信号的核酸序列由以下序列组成：

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT(SEQ ID No.1)。

9.如权利要求1所述的双重构建体系统，所述剪接受体信号的核酸序列由以下序列组成：

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(SEQ ID No.2)。

10.如权利要求1所述的双重构建体系统，所述第一质粒还包含至少一个增强子序列，所述增强子序列可操作地连接所述编码序列。

11.如权利要求1所述的双重构建体系统，所述编码序列是编码能够修正遗传性视网膜变性的蛋白质的核苷酸序列。

12.如权利要求11所述的双重构建体系统，所述编码序列选自：ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98或ALMS1。

13.一种双重病毒载体系统，其包含：

a)第一病毒载体，其含有权利要求1-12中任一项定义的第一质粒，以及

b)第二病毒载体，其含有权利要求1-12中任一项定义的第二质粒。