[发明专利]细胞分离的方法

说明书

本发明涉及以下组分的组合的应用：(i)大分子红细胞沉降增强因子，和，(ii)二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甘氨酸(DMG)和/或缬氨酸；以从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞，和/或事先准备非红细胞的血细胞以在随后的冷冻贮藏步骤中保护它们的完整性。

技术领域

本发明涉及用于分离细胞和/或事先准备细胞的方法和组合物，更具体涉及用于从外周血、骨髓、脐带血和相关的血液组织中分离红细胞的方法和组合物。

背景技术

从血液中分离白细胞用于体外研究或细胞疗法通常包括主要基于构成细胞物质99％的红细胞大量损耗的血液的初始分离。

红细胞去除技术是基于红细胞的低渗裂解、密度梯度分离、增强的离心沉降，其中增强的离心沉降使用羟乙基淀粉或促使红细胞加速沉降的混合物(其中还包含抗体)。

低渗裂解不仅可用于体外的小体积研究，而且也可应用于为细胞疗法所处理的大体积血液组织。在细胞疗法程序中，通常将进行红细胞的低渗裂解作为最终步骤，以在通过其他方法发生大量损耗之后，去除样品中剩余的污染的红细胞。

密度梯度分离依赖于细胞类型密度的差异，其中细胞类型密度的不同导致细胞被隔离在处于不同水平的具有不同密度的流体介质中。细胞类型之间的密度差异可能较小，而且不同的细胞类型在大小和密度上可能是多种多样的。因此，特定的细胞类型可能在分布整个密度梯度介质中，而不是精确地沉降在密度介质中的独立区域处，因此使得所需细胞的回收降低和/或被不需要的细胞类型污染。

在富集罕见血液细胞类型(诸如造血祖细胞)的程序中，密度梯度沉降可引起所需细胞子集的丢失或产量降低。例如，使用常规的密度梯度方法从脐带血中隔离祖细胞，导致所需的干细胞，例如CD34⁺造血干细胞(HSC)或VSEL(极小类胚胎样干细胞)的显著丢失(Wagner,J.E.,Am J Ped Hematol Oncol 15:169(1993))。使用常规密度梯度方法隔离淋巴细胞可导致特定的淋巴细胞子集出现选择性丢失(Collins,J Immunol Methods 243:125(2000))。

这些分离方法具有用于细胞疗法的额外的禁忌，因为如果与细胞一起灌输到容器中，分离介质中的化学实体可能是有毒性的。同样，必须进行额外的步骤，以确保在灌输之前将它们完全去除。诸如淘析的仪器方法学还依赖于血液组分通过密度进行差动分离(differential separation)，并且可能受性能上的类似缺陷之苦。

从血液中去除红细胞的另一种方法是利用羟乙基淀粉，它刺激红细胞聚集，然后在离心机中以50×g沉降时发生比白细胞组分更快速地沉降。虽然该方法对受体通常是无毒性的，但是其回收重要细胞类型的性能，包括例如间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)和VSEL是多变的，并且对于例如脐带血，可能导致干细胞的回收不太理想，而且脐带血细胞的植入潜能降低，从而增加了移植失败的风险。

最近报道的方法已经公开(EP 2,117,592；US 7,598,089)，涉及将不凝结的血液与一种组合物混合，该组合物包括：葡聚糖；抗血型糖蛋白A的抗体；除了其他抗体种类之外(例如，抗CD9抗体；抗CD15抗体；和串联抗体，其中已将两种不同的抗体连接在一起以形成单一的实体)。抗体是细胞分离和从血液中回收感兴趣的有核细胞的方法的昂贵的解决方法。

提高罕见细胞类型从供体组织中的回收率会大大改善移植和免疫疗法的结果(例如，骨髓移植、基于干细胞的基因疗法和免疫细胞疗法)，这些疗法的成功与进行治疗应用所引入的细胞的实际数量有关。本发明期望提供一种产生高比例的感兴趣的活细胞的细胞分离方法。

发明内容