[发明专利]用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌

说明书

本发明涉及一种含有3种质粒的、用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌。本发明的土壤杆菌属细菌含有下述(1)～(3)的质粒：(1)具有下述构成要素的质粒；(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因，及(ii)复制起点，(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及(3)具有由期望的DNA构成的T‑DNA区域的质粒；这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

技术领域

本申请主张基于2013年3月29日提出的日本申请特愿2013-072177的优先权，在本说明书中引入其全部内容。

本发明涉及含有3种质粒的、用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌及其用途。

背景技术

对于植物的转化而言，通常利用向植物细胞导入外来DNA的技术，使得能够在结果种子的后代或营养繁殖体中保持并表达外来基因。使用该技术，实际上能够对非常多的单子叶植物、双子叶植物进行转化。对于转化作物而言，除了玉米、水稻、小麦、大麦、高梁、大豆、油菜籽、向日葵、棉花、马铃薯、番茄等，还能制作水果类、其它的蔬菜类，在商业上也很受关注。

在植物的转化方法中，已知有聚乙二醇法、电穿孔法、基因枪法等物理/化学的方法(DNA的直接导入法)和利用土壤杆菌属细菌具有的功能的生物学的方法(DNA的间接导入法)。在直接导入法中，高频率地发生使目的基因片段化而导入的、多拷贝导入的现象。因此，高频率地出现未表达目的基因的转化体、较弱地显示出异常表达(基因沉默)的转化体。另外，在使用原生质体的方法中，由于培养时间长期化，因此，在得到的转化体中，容易发生培养变异引起的种子不结果或畸形等。相比之下，经由土壤杆菌属细菌的基因导入法不容易发生这样的问题。在土壤杆菌属法中，通过控制Ti或Ri质粒的病原性区域(vir区域)中的基因群的表达来导入目的基因。根据vir基因所编码的蛋白质群，目的基因经过植物细胞与细菌的相互作用的识别和信号转导、vir基因的表达诱导、IV型分泌通路的形成、T-DNA边界重复序列的识别、T-DNA链的形成、T-DNA链向植物细胞的转移和向核的转移、以及T-DNA向植物核基因组的插入等多个过程而导入。因此，较低地保持目标基因的导入拷贝数，发生片段化而导入的情况较少。其结果是，在得到的转化体中目标基因高表达的个体数量多且能稳定地得到，与直接导入法相比，存在表达量的个体之间差异较小的巨大优点。

这样，土壤杆菌属法是非常优异的植物转化方法，但是，实际情况是转化的能否成功以及效率依赖于植物种类、基因型以及使用的植物组织，有很大差异(Potrykus et al.,1997)。仍然不能以充分的效率进行转化的植物还有很多，在现实情况下，可以容易地获得多个转化体的作物的种类仅限定于一部分。因此，强烈地期望能够解决这样问题的改进方法。

迄今为止开发了各种转化用载体，进行了解决上述问题的努力。以下，对与载体开发有关的背景进行说明。原来，野生型土壤杆菌属的Ti质粒巨大，为190kb以上，因此，在标准的基因工程的方法中，难以在质粒上的T-DNA中插入基因。因此，开发了用于在T-DNA上插入外来基因的方法。首先，制作了作为具有从肿瘤性的Ti质粒的T-DNA中除去了植物成长调节物质合成基因的卸甲型Ti质粒的菌系的LBA4404(Hoekemaet al.,1983)、GV3850(Zambryski etal.,1983)、GV3TillSE(Fraley et al.,1985)、C58-Z707(Hepburn et al.,1985)、GV3101::pMP90(Koncz and Schell,1986)、GV3101::pMP90RK(Koncz and Schell,1986)、GV2260(McBride and Summerfelt,1990)、NTI(pKPSF2)(Palanichelvam et al.,2000)等。