[发明专利]一种低温堆肥接种剂及其制备和应用

权利要求书

1.一种低温堆肥接种剂，其特征在于，由以下菌种组成：毕赤酵母(Pichia pastoris)VT-21，菌体浓度为5.0×10⁸～5.0×10⁹cfu/mL；嗜冷枯草芽胞杆菌(Bacilluspsychrphilus)HH，菌体浓度为5.0×10⁸～5.0×10⁹cfu/mL；假单胞菌(Pseudomonas spp.)B5-16，菌体浓度为1.0×10⁹～1.0×10¹⁰cfu/mL；假单胞菌(Pseudomonas spp.)B6-15，菌体浓度为1.0×10⁹～1.0×10¹⁰cfu/mL。

2.根据权利要求1所述的低温堆肥接种剂，其特征在于，所述低温堆肥接种剂由以下菌种组成：毕赤酵母(Pichia pastoris)VT-21，菌体浓度为1.0×10⁹～5.0×10⁹cfu/mL；嗜冷枯草芽胞杆菌(Bacillus psychrphilus)HH，菌体浓度为5.0×10⁸～1.0×10⁹cfu/mL；假单胞菌(Pseudomonas spp.)B5-16，菌体浓度为4.0×10⁹～1.0×10¹⁰cfu/mL；假单胞菌(Pseudomonas spp.)B6-15，菌体浓度为4.0×10⁹～1.0×10¹⁰cfu/mL。

3.权利要求1或2所述的低温堆肥接种剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1).斜面培养：无菌条件下，将毕赤酵母VT-21、嗜冷枯草芽胞杆菌HH分别接种至PDA、LB固体培养基斜面，假单胞菌B5-16和假单胞菌B6-15接种至NA固体培养基斜面上，将毕赤酵母VT-21、嗜冷枯草芽胞杆菌HH于25～35℃条件下培养2～3天，假单胞菌B5-16、假单胞菌B6-15于20～30℃条件下培养1～2天；

2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基中，即对应的液体培养基，具体为：毕赤酵母VT-21接种至PDA液体培养基、嗜冷枯草芽胞杆菌HH接种至LB液体培养基、假单胞菌B5-16和假单胞菌B6-15接种至NA液体培养基，毕赤酵母VT-21、嗜冷枯草芽胞杆菌HH在25～35℃条件下，160r/min摇床培养2～3天，假单胞菌B5-16、假单胞菌B6-15均20～30℃条件下，170r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD₆₀₀值为3.0-4.0时停止培养，制得一级种子液；

3).二级种子培养：将一级种子液分别接种于装有液体培养基的锥形瓶中，即对应的液体培养基，具体为：毕赤酵母VT-21接种至PDA液体培养基、嗜冷枯草芽胞杆菌HH接种至LB液体培养基、假单胞菌B5-16和假单胞菌B6-15接种至NA液体培养基，毕赤酵母VT-21、嗜冷芽胞杆菌HH在25～35℃条件下，160r/min摇床培养1～2天，假单胞菌B5-16、假单胞菌B6-15均于20～30℃、170r/min恒温震荡摇床中培养1～2天，单菌种液体培养OD₆₀₀值3.0-4.0之间时停止培养，制得二级种子液；

4).混合发酵培养：先接种毕赤酵母菌和嗜冷芽胞杆菌的二级种子液培养1天，再接种B5-16的二级种子液培养1天，最后接种B6-15的二级种子液后再培养2天，共培养4天时间。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，一级种子液的接种量为体积比4-6％；步骤4)中二级种子液的接种量为体积比1％～3％。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述发酵培养基为：糖蜜3％、玉米浆粉8％、硫酸镁0.2％、氢氧化钠0.15％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，余量为水。