[发明专利]一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法。

背景技术

微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物，个体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜放大约1000倍才能看到，土壤中微生物的种类较多，有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物等。数量也很大，l克土壤中就有几亿到几百亿个。大部分土壤微生物对作物生长发育是有益的，它们对土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等均有重大影响。

首先，土壤微生物可以形成土壤结构。土壤并不是单纯的土壤颗粒和化肥的简单结合，作为土壤的活跃组成分,土壤微生物在自己的生活过程中，通过代谢活动的氧气和二氧化碳的交换，以及分泌的有机酸等有助于土壤粒子形成大的团粒结构，最终形成真正意义上的土壤。土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切关系。其次，土壤微生物最显著的成效就是分解有机质，比如作物的残根败叶和施入土壤中的有机肥料等，只有经过土壤微生物的作用，才能腐烂分解，释放出营养元素，供作物利用，并形成腐殖质，改善土壤的结构和耕性。正是由于土壤中含有的腐殖质、重金属、多糖类、多酚类等物质造成了土壤微生物基因组DNA提取困难，腐殖质由于具有与DNA类似的性质，因此可以在DNA常规抽提中与DNA共沉淀，腐殖质极少量的存在就可以强烈地抑制PCR反应。

因此需要研制适用于土壤微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，所述方法能够更有效、快速、经济地提取到土壤微生物基因组DNA。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，包括土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎，杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，所述方法具体包括以下步骤：

1)土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎：称取1-10g土壤于50ml离心管中，加入10-20ml裂解液，震荡裂解1-10min，于60-70℃温育1-2h，温育期间每5-10min震荡1-2次；温育后，10000-12000rpm/min离心20-30min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入0.125-0.2倍一次上清液体积的1-10mol/L醋酸钾和0.4-1倍一次上清液体积的质量浓度40-60％聚乙二醇-800(PEG-800)，于-20℃静置30-60min，然后10000-12000rpm/min离心20-60min，弃废液后加入15-25ml CTAB-NaCl-EDTA溶液溶解沉淀，然后于65-80℃温育30-60min；

2)杂蛋白的抽除：温育后，在上述离心管中加入15-20ml抽提液A抽提，10000-13000rpm/min离心10-30min，取二次上清液至无菌的离心管中，加入15-20ml抽提液B抽提，10000-13000rpm/min离心10-30min，取三次上清液至灭菌的离心管中；

3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在上述离心管中加入与三次上清液等体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱中，然后10000-13000rpm/min离心1-5min，弃废液，加入200-600μl去蛋白液，然后10000-13000rpm/min离心1-5min，弃废液，加入200-600μl漂洗液，然后10000-13000rpm/min离心1-5min，弃废液，加入200-600μl漂洗液，然后10000-13000rpm/min离心1-5min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干；

4)DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入100-200μl洗脱液，然后10000-13000rpm/min离心1-5min，所得液体为土壤微生物基因组DNA；后续取2-7μl DNA水溶液，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测；

其中，所述裂解液由终浓度0.25-1mol/L氯化钠(Nacl)，终浓度0.1-1mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，质量体积比4-8％十二烷基硫酸钠(SDS)和终浓度0.3-1mol/L异硫氰酸胍组成；

所述CTAB-NaCl-EDTA溶液由质量体积比1-5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),终浓度1-2mol/L氯化钠(Nacl)和终浓度0.1-0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)组成；

所述抽提液A是指体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；