[发明专利]受铁-细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用

说明书

本发明涉及受铁‑细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用。首次揭示一种受“铁‑细菌密度”二元信号调控的蛋白表达系统(ironQS)，巧妙地应用细菌群体感应系统与Fur box相结合，使得外源蛋白的双重调控表达成为可能。

技术领域

本发明涉及生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种受“铁-细菌密度”二元信号调控的蛋白表达系统及其应用。

背景技术

细菌细胞能够释放一种称为自诱导物(Autoinducer，AI)的小分子化学物质，自诱导物随着附近环境中的菌体浓度增加而逐渐积累，当其浓度达到某个阈值时会被细菌检测到并产生响应，使得菌体统一产生基因表达的变化，这个过程被称为群体感应(QuorumSensing，QS)。微生物的群体感应系统是近几年来备受关注的细菌之间相互交流的群体调控机制。其中，最显著的是在费氏弧菌中lux群体感应系统调控了该微生物的生物发光现象。该系统不但首先被人们发现，并且作为典型的革兰氏阴性菌的群体感应系统被详细研究，从自诱导物合成酶的作用机制、自诱导物的详细结构、受体蛋白-自诱导物复合物与DNA的结合方式，最终到整个系统所调控的基因功能，每个方面的点滴发现总能为人们研究微生物的相互通讯提供重要参考。群体感应系统中自诱导物与受体蛋白的结合特异性，调控基因和信号转导中体现出的多样性和复杂性，以及在病原菌中该系统与致病能力的密切联系，使得该机制已成为生物学、医学等领域的研究热点。

金属元素是生物体内蛋白质的重要组分，其中大多数可作为蛋白质的辅因子，如Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Fe^2+/3+。不同种属的微生物对金属离子的需求是不同的，为了维持细胞的活力，金属离子在细胞内的浓度必须得到严格的调控。除了某些乳酸杆菌和包柔氏螺旋体外，铁、锰和锌元素对于所有微生物的生长都是不可或缺的。尽管金属离子在细菌代谢中有着举足轻重的地位，但是其中一些离子在生物界中并不能轻易获得。自然环境中的铁基本都是氢氧化物或者氧化物，溶解度非常低，因此在水生环境中，铁缺乏是最普遍的一种营养压力，也是海洋初级生产力最主要的制约因素。为了在这种限铁环境中得以生存，细胞演化出一系列针对性措施，如减小体积、降低次级代谢、合成替代蛋白和提升获取通路的表达等。这些手段能够维持细胞内的铁平衡，在环境发生变化时通过改变基因表达进行适应。为了调控铁离子的代谢同时将其用于抵抗氧化压力，细菌进化出许多涉及铁的摄取、运输和存储的系统，这些系统的功能是由铁摄取调控子(Ferric uptake regulator，Fur蛋白)来完成的。Fur蛋白在大多数原核生物中控制着铁的代谢。在典型的革兰氏阴性菌大肠杆菌中，使用被称为铁载体的胞外铁螯合剂将环境中的铁溶解，有效地运输到细胞质中。但是，本领域目前还没有Fur蛋白是否能与细菌的其它系统协同作用的研究报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种受铁-细菌密度二元信号调控的蛋白表达系统及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于二元信号调控的表达构建物，所述表达构建物包括：细菌群体感应系统编码序列，和Fur蛋白结合位点(Fur box)序列，两者操作性连接。

在一个优选例中，所述的表达构建物中，还包括位于各序列之间以及各序列两端的限制性内切酶位点；特别是包括用于插入外源蛋白编码序列的位点。

在另一优选例中，所述的细菌群体感应系统是基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)体内系统构建的细菌群体感应系统；较佳地为luxR-PluxR-PluxI-luxI系统。

在另一优选例中，所述的表达构建物中还包括：外源蛋白的编码序列，其与所述的细菌群体感应系统编码序列和Fur蛋白结合位点(Fur box)序列操作性连接；且，所述的外源蛋白的表达受到铁离子浓度以及细菌浓度的双重调控。

在另一优选例中，所述的Fur蛋白结合位点序列来源于大肠杆菌；更佳地其具有GATAATGATAATCATTATC序列。