[发明专利]一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法和检测方法。

背景技术

吸道微生物群系研究是一个相对较新的领域，16S rRNA基因序列分析是目前常用于鉴定细菌菌种的分子检测技术，已被广泛应用于环境以及临床标本的研究，呼吸道微生物群系研究是一个相对较新的领域。16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，该技术的基本原理是从微生物样本中获取16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。因此，相对于传统的细菌培养技术，16S rRNA序列分析能够准确鉴定出细菌的种属，并显示该种细菌在某部位的相对丰度。

支气管肺泡灌洗液是通过纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，反复以无菌生理盐水灌洗、回收而获得。如何针对获得的肺泡灌洗液进行针对性的DNA分析是检测肺泡16SrRNA基因序列分析的前提。目前，国内还缺乏获取16S rRNA基因序列分析的有效肺泡灌洗液标本的收集方法。鉴于16S rRNA基因序列分析技术的重要性，而支气管肺泡灌洗液是检测下呼吸道菌群最准确、受口腔污染最少的标本，以及我国目前尚没有针对用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法，提供一种有效可靠的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的肺泡灌洗液收集方法十分必要。

发明内容

本发明旨在提供一种安全、简便、污染少、重复性好的16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集和检测的方法，具体涉及一种获取肺泡灌洗液及进行基因组DNA提取与16S rRNA基因序列分析。本发明针对获取肺泡灌洗液、进行基因组DNA提取与16S rRNA基因序列分析的要求，提供一种用于16S rRNA基因序列分析的肺泡灌洗液的收集和检测的方法。

本发明提供的技术方案为：一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：受试者雾化吸入支气管扩张剂可必特(复方异丙托溴铵溶液)2.5ml，停留静脉留 置针，在所述的肺泡灌洗液收集的整个过程中鼻导管持续给氧，同时监测经皮氧饱和度心率等,了解机体缺氧状况并作出及时正确的评估和处理；

步骤2：上鼻道和咽喉部予2％利多卡因5ml氧气雾化进行表面麻醉，随后静脉注射咪达唑仑2～10mg和阿芬太尼125～500mg；

步骤3：纤维支气管镜通过鼻道进到声门区，予2％利多卡因2-5ml麻醉声门区；

步骤4：将支气管镜送入主气管，左右主支气管各注入2％的利多卡因溶液2-3ml后，将支气管镜楔入右肺中叶肺段B4并固定；

步骤5：通过50ml注射器将室温生理盐水50ml缓慢注入右肺中叶完毕后立即以2.5～3.5ml/S匀速抽吸进行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液；

步骤6：取另一支50ml注射器将室温生理盐水50ml缓慢注入右肺中叶完毕后立即以2.5～3.5ml/S匀速抽吸进行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。

步骤7：将第一次灌洗液和第二次灌洗液进行混合。

在上述的用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法中，所述的步骤5和步骤6中，注射器的规格均为50ml。

本发明还提供一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液检测方法，包括以下步骤:

步骤1：将离体的肺泡灌洗液离心分离得到沉淀物，所述的沉淀物为离体的肺泡灌洗液沉淀物标本；

步骤2：提取离体的肺泡灌洗液沉淀物标本中的DNA，得到DNA标本；

步骤3：对DNA标本进行电泳，判断DNA的浓度和降解程度，获得用于16S rRNA基因序列分析的离体的肺泡灌洗液质量的评价指标；

步骤4：对经过步骤4检测的DNA标本进行文库构建；

在上述的用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液检测方法中，步骤2具体包括以下子步骤：

子步骤21：离体的肺泡灌洗液沉淀物标本中分别先后加入430～434μl TE缓冲液及17～19μl含溶菌酶的工作液；

子步骤22：37±1℃水浴50～70min；

子步骤23：分别先后加入29～31μl蛋白酶K及440～460μl AL缓冲液；

子步骤24：56±1℃水浴25～35min后95±1℃水浴4～6min；