[发明专利]一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法和检测方法

权利要求书

1.一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：受试者雾化吸入支气管扩张剂可必特复方异丙托溴铵溶液2.5ml，停留静脉留置针，在所述的肺泡灌洗液收集的整个过程中鼻导管持续给氧，同时监测经皮氧饱和度心率，根据机体缺氧状况做出相应处理；

步骤2：上鼻道和咽喉部予2％利多卡因5ml氧气雾化进行表面麻醉，随后静脉注射咪达唑仑2～10mg和阿芬太尼125～500mg；

步骤3：纤维支气管镜通过鼻道进到声门区，予2％利多卡因2～5ml麻醉声门区；

步骤4：将支气管镜送入主气管，左右主支气管各注入2％的利多卡因溶液2-3ml后，将支气管镜楔入右肺中叶肺段B4并固定；

步骤5：通过50ml注射器将室温生理盐水50ml缓慢注入右肺中叶完毕后立即以2.5～3.5ml/S匀速抽吸进行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液；

步骤6：取另一支50ml注射器将室温生理盐水50ml缓慢注入右肺中叶完毕后立即以2.5～3.5ml/S匀速抽吸进行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。

步骤7：将第一次灌洗液和第二次灌洗液进行混合。

2.根据权利要求1所述的用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液收集方法，其特征在于，所述的步骤5和步骤6中，注射器的规格均为50ml。

3.一种用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液检测方法，其特征在于，包括以下步骤:

步骤1：将离体的肺泡灌洗液离心分离得到沉淀物，所述的沉淀物为离体的肺泡灌洗液沉淀物标本；

步骤2：提取离体的肺泡灌洗液沉淀物标本中的DNA，得到DNA标本；

步骤3：对DNA标本进行电泳，判断DNA的浓度和降解程度，获得用于16S rRNA基因序列分析的离体的肺泡灌洗液质量的评价指标；

步骤4：对经过步骤4检测的DNA标本进行文库构建。

4.根据权利要求3所述的用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液检测方法，其特征在于，步骤2具体包括以下子步骤：

子步骤21：离体的肺泡灌洗液沉淀物标本中分别先后加入430～434μl TE缓冲液及17～19μl含溶菌酶的工作液；

子步骤22：37±1℃水浴50～70min；

子步骤23：分别先后加入29～31μl蛋白酶K及440～460μl AL缓冲液；

子步骤24：56±1℃水浴25～35min后95±1℃水浴4～6min；

子步骤25：加入浓度为99.9％的无水酒精440～460μl后静置得到悬浊液；

子步骤26：将混悬液转移到Qiagen分离管中；

子步骤27：离心，收集滤过的DNA；

子步骤28：加入洗涤剂洗涤DNA；

子步骤29：溶解洗涤后的DNA并在-20℃条件下保存。

5.根据权利要求3所述的用于16S rRNA基因检测的支气管肺泡灌洗液检测方法，其特征在于，所述的离体的肺泡灌洗液通过以下步骤获取：

步骤1：受试者雾化吸入支气管扩张剂可必特复方异丙托溴铵溶液2.5ml，停留静脉留置针，在所述的肺泡灌洗液收集的整个过程中鼻导管持续给氧，同时监测经皮氧饱和度心率，根据机体缺氧状况做出相应处理；

步骤2：上鼻道和咽喉部予2％利多卡因5ml氧气雾化进行表面麻醉，随后静脉注射咪达唑仑2～10mg和阿芬太尼125～500mg；

步骤3：纤维支气管镜通过鼻道进到声门区，予2％利多卡因2-5ml麻醉声门区；

步骤4：将支气管镜送入主气管，左右主支气管各注入2％的利多卡因溶液2-3ml后，将支气管镜楔入右肺中叶肺段B4并固定；

步骤5：通过50ml注射器将室温生理盐水50ml缓慢注入右肺中叶完毕后立即以2.5～3.5ml/S匀速抽吸进行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液；

步骤6：取另一支50ml注射器将室温生理盐水50ml缓慢注入右肺中叶完毕后立即以2.5～3.5ml/S匀速抽吸进行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。

步骤7：将第一次灌洗液和第二次灌洗液进行混合。